人MTERF3在脑胶质瘤的表达及其对脑胶质瘤U251细胞增殖的影响

发布时间：2020-05-26 09:09

【摘要】：背景与目的脑胶质瘤是目前人类肿瘤中最为常见的原发性中枢神经系统肿瘤,约占原发性中枢神经系统肿瘤的30%~40%,是生存时间最短及预后最差的疾病类型之一。随着社会的发展,肿瘤已经成为人类较为常见的疾病,肿瘤的死亡率仅次于心血管疾病位居第二,是目前威胁人类健康最重要的疾病之一。尽管近年来随着医疗水平的发展,手术治疗、放射治疗及药物化疗等常规治疗手段取得了较大的进步,但由于脑胶质瘤浸润生长的特性,导致肿瘤部位难以彻底切除而复发,影响脑胶质瘤治疗的预后,且目前诊疗脑胶质瘤的分子标记物仍然非常有限。近年来,随着分子生物学认识的不断深入,分子靶向逐渐成为治疗肿瘤新的治疗措施,其成为现代医学肿瘤学治疗的重要组成部分。人线粒体转录终止因子3(human mitochondrial transcription termination factor 3,hMTERF3)是一个负调控线粒体基因表达和氧化磷酸化活性的蛋白质。已有研究报道,hMTERF3基因拷贝数扩增及其过表达对肝细胞癌、乳腺癌、非小细胞肺癌和胰腺癌的发生、进展和预后有重要作用,但目前,关于hMTERF3在脑胶质瘤中的表达及其预后意义尚未见相关报道。本课题首先基于TCGA和Oncomine数据库进行数据挖掘并分析hMTERF3的表达与脑胶质瘤临床病理特征的关系,探讨hMTERF3表达水平与脑胶质瘤患者预后的相关性。通过免疫组织化学技术观察hMTERF3蛋白在脑胶质瘤和非肿瘤性脑组织中的表达。构建及鉴定重组真核表达载体p3×FLAG-CMV-hMTERF3,并利用生物信息学方法预测hMTERF3蛋白的结构与功能。进一步研究转染重组真核表达载体p3×FLAG-CMV-hMTERF3对脑胶质瘤U251细胞的线粒体DNA拷贝数、线粒体蛋白表达水平及其细胞增殖、细胞周期等生物学行为的影响。本研究将为阐明hMTERF3在脑胶质瘤发生和发展中的作用奠定实验基础,也为脑胶质瘤的诊断和治疗提供潜在的分子靶标。方法利用Oncomine数据库检索关于hMTERF3基因的信息,并对hMTERF3基因在脑胶质瘤中的表达进行荟萃分析;利用Bioconductor/TCGA biolinks函数包从TCGA数据库(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)下载临床资料数据,使用R3.3.0软件对TCGA数据库中526例脑胶质瘤患者的临床病理参数与hMTERF3表达水平进行相关性分析。使用Graphpad 5.0软件对TCGA数据集中高表达hMTERF3和低表达hMTERF3的脑胶质瘤患者的预后生存进行Kaplan-Meier分析。同时,在大理州人民医院收集2008~2012年的20例脑胶质瘤组织及16例非肿瘤性脑组织标本进行免疫组化。20例脑胶质瘤患者中男性13例,女性7例,年龄14~62岁,均为首次确诊,手术前未经化疗、放疗。采用免疫组织化学方法检测上述标本中hMTERF3蛋白的表达情况,并比较其表达水平的差异;根据NCBI数据库中hMTERF3基因序列设计引物,采用聚合酶链式反应从pGEM-hMTERF3重组克隆载体中扩增出hMTERF3基因开放阅读框序列,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切后,连接入真核表达载体p3×FLAG-CMV-14的多克隆位点中,构建重组质粒p3×FLAG-CMV-hMTERF3,分别用菌落PCR、限制性核酸内切酶和DNA序列分析3种方法鉴定重组子;利用不同的生物信息学软件对hMTERF3蛋白进行系统研究,包括hMTERF3的理化性质、二级结构功能域、亚细胞定位、同源蛋白多重序列比对、系统发育树构建及三级结构同源建模;采用半定量PCR和Western blot检测过表达hMTERF3对脑胶质瘤U251细胞线粒体DNA拷贝量变化、线粒体编码蛋白的表达水平。采用流式细胞术和MTT法检测过表达hMTERF3对细胞周期及细胞增殖的影响。结果1、利用Oncomine数据库分析发现,hMTERF3在脑胶质瘤组织中呈现高表达。TCGA数据库中下载得到526例脑胶质瘤患者的临床病理资料,通过使用R软件分析结果显示,hMTERF3的表达与年龄(P=0.010)、肿瘤原发部位(P=0.048)、幕上定位(P=0.041)、等级(P0.001)及病理类型(P0.001)明显相关。而与性别、发病部位、头痛史、样本类型无关(均P0.05)。进一步利用Kaplan-Meier Plotter数据库分析hMTERF3表达对脑胶质瘤患者生存时间的影响发现,hMTERF3高表达组的OS(P=0.001,HR=2.03)及DFS(P=0.004,HR=1.54)均低于hMTERF3低表达组,两组间比较差异具有统计学意义。多因素分析结果显示,年龄、肿瘤原发部位等均是影响脑胶质瘤患者预后的独立预后因素(P0.05)。免疫组化分析表明,hMTERF3蛋白在脑胶质瘤组织中高表达,而在非肿瘤性脑组织中低表达,在脑胶质瘤组织中hMTERF3蛋白的表达主要定位在细胞质中,呈浅黄色或棕黄色染色。其中脑胶质瘤组织中hMTERF3蛋白的阳性表达较强,染色较深,而在非肿瘤性脑组织中也可观察到hMTERF3蛋白的表达,但染色较浅。2、利用不同的生物信息学软件对hMTERF3蛋白进行系统研究发现,hMTERF3蛋白的二级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲,同时包含6个MTERF基序,三级结构预测结果与二级结构预测结果相一致;亚细胞定位结果显示,该蛋白定位于人线粒体内;同源蛋白多重序列比对和进化分析显示,该蛋白与大鼠、小鼠等哺乳动物的MTERF3蛋白具有高度的同源性,且亲缘关系更近。重组质粒p3×FLAG-CMV-hMTERF3经双酶切鉴定和菌落PCR鉴定均获得大小为1254bp的目的条带,DNA序列分析结果表明该序列与GenBank中hMTERF3基因序列的同源性达到100%,插入基因的大小和方向均正确。3、转染脑胶质瘤U251细胞后通过半定量PCR检测线粒体DNA拷贝量发现,过表达hMTERF3对线粒体DNA的复制起显著抑制作用;Western blot检测发现hMTERF3过强表达会降低线粒体编码的ND1蛋白水平;MTT检测结果显示,过表达hMTERF3促进U251细胞的增殖;流式细胞术分析细胞周期发现,hMTERF3过强表达能促进细胞增殖,并导致细胞顺利通过G1/S控制点,细胞周期未出现阻滞和凋亡。结论1、研究表明,基于TCGA和Oncomine数据库获取脑胶质瘤组织中hMTERF3表达的相关信息,为深入研究hMTERF3在脑胶质瘤发生发展中的作用奠定基础。免疫组化检测hMTERF3蛋白在人脑胶质瘤中的表达增高,提示hMTERF3可能参与人脑胶质瘤的发生发展,并且可能与肿瘤的恶性程度密切相关。2、成功构建hMTERF3基因的真核表达载体,为进一步研究hMTERF3基因在恶性肿瘤发生发展中的作用奠定基础;利用不同的生物信息学软件分析该蛋白的结构,这为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。3、在脑胶质瘤U251细胞中过表达hMTERF3显著抑制线粒体DNA的复制水平,并且影响线粒体编码ND1蛋白质的表达水平。同时过表达hMTERF3能显著促进U251细胞增殖,促进细胞周期G0/G1期向S期的转变进程,并且不导致细胞凋亡。
【图文】：

链和轻链复制起点（箭头表示方向），黄色方框表A 和编码蛋白的基因。图 1-1. 人线粒体 DNA 结构图 为双链闭合环状，，外环称重链(H)，内环称于两条链所含有的核苷酸不同所引起的，重A 分子量较大，而轻链胞嘧啶所占比重较多编码氧化磷酸化呼吸链复合体亚基上的 12 种，而轻链只编码氧化磷酸化呼吸链复合体亚NA。线粒体 DNA 上的基因排列非常紧凑，一小段 D 环区(displacement loop)无基因编码含有线粒体 DNA 复制及转录所需要的调控序uence box, CSB)、复制相关的终止结合序列（和线粒体 DNA 转录的启动子序列[12,13]。线，重链上 2 个(HSP1,HSP2)及轻链上 1 个(LS

高迁移蛋白家族(HMG)。在线粒体DNA的复制、转录和挥重要的作用[28,29]。线粒体转录因子B(TFB1M,TFB2M)重要调控因子，由核基因编码通过特殊的方式转运到线TFB2M与线粒体RNA聚合酶（POLRMT）形成异源二启动子开始转录[30]。转录终止因子(mitochondrial transcription termination fact因编码通过特殊的方式转运到线粒体，并能与mtDNA在线粒体DNA的复制、转录以及翻译中发挥调控作用[发现，线粒体转录终止因子蛋白家族有4个成员(MTETERF2仅存在于脊柱动物中，而MTERF3和MTERF4在都存在，并且它们之间都含有亮氨酸拉链样结构和与m蛋白家族主要的特征是：定位于线粒体和存在不定重复数氨基酸折叠而成的亮氨酸拉链结构）。
【学位授予单位】：大理大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.41

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本文编号：2681608