亚低温治疗全脑缺血再灌注，改善神经功能的作用与机制研究

发布时间：2020-05-27 07:29

【摘要】：目的:全脑的缺血再灌注损伤是严重危害人类健康的常见急症。以心脏停跳复苏后的全脑缺血再灌注为例,全脑的缺血再灌注损伤患者的最终存活率大约只有12%,存活者中具有良好神经功能的患者少于5%。亚低温治疗是目前唯一在临床上被证实的在心脏停跳恢复自主循环后能有效提高生存率和改善神经系统预后的治疗方式。但是在亚低温治疗中,亚低温起始时间和持续时间的选择对于提高治疗效果十分重要,明确最佳亚低温起始时间和持续时间的作用与机制意义重大。Calpain是非溶酶体中性半胱氨酸蛋白水解酶家族中的成员,其活动依赖于钙,并受特异性内源性抑制物钙蛋白酶抑素的调节。目前报告的calpain共有11种亚型,在脑组织中最丰富最具特征的的亚型为μ-calpain和m-calpain。Bendarski的研究表明,μ-calpain在脑缺血后calpain调节脑组织的病理生理过程中发挥主要作用。Liebetrau等人发现,亚低温能够减少脑缺血再灌注后calpain的活动及其引起的蛋白水解,这一研究提示抑制calpain的活动,能够保护脑缺血再灌注后的神经元。而在体内还需要进一步研究m-calpain和μ-calpain在脑缺血再灌注损伤的作用。镁离子具有多种功效,它是天门冬氨酸(NMDA)受体和钙离子的拮抗剂,又是血管扩张剂,而且多种脑损伤动物实验证实硫酸镁对血脑屏障还具有保护作用。Miles等人通过静脉输入硫酸镁抑制了短暂前脑缺血再灌注后大鼠海马CA1区神经元的凋亡,而Zhu等人发现静脉输入硫酸镁与亚低温治疗相结合能进一步减少短暂全脑缺血再灌注大鼠海马CA1区神经元的凋亡。但是仍需要检验亚低温治疗结合静脉输入硫酸镁对心跳骤停后全脑缺血再灌注的神经保护效果,为临床医疗提供新的思路及理论支持。研究方法:1.采用雄性成年Long Evans大鼠建立10min窒息心脏停跳心肺复苏全脑缺血动物模型。2.在大鼠恢复自主循环后,随机分组为常温治疗(37±1℃)和亚低温治疗(33±1℃)。亚低温治疗根据治疗的起始时间分为0,1,4或8小时后治疗组,亚低温维持24或48小时。3.复苏后连续7天观察大鼠的生存状态,应用Kaplan-Meier分析,比较各组的生存率。4.将存活7天评分大于等于450分定为神经功能良好,通过卡方检验比较组间差异。5.灌注存活7天的大鼠取脑,切片后行Hoechst和NeuN双染色,在荧光显微镜下用立体体视学技术对大鼠海马CA1区存活的正常形态神经元进行计数,用方差分析将各组平均值进行比较。6.在雄性成年Long Evans大鼠体内海马CA1区原位进行RNA干扰转染,降低μ-calpain和m-calpain表达。7.经过6分钟短暂前脑缺血(TFI)再灌注,分别在72小时和2周取脑,进行切片和免疫荧光染色,荧光显微镜下观察降低μ-calpain和m-calpain表达缺血再灌注损伤后神经元的存活。8.采用原代培养神经元,在NDMA介质中模拟缺血再灌注过程,观察亚低温结合镁离子联合作用下神经元的存活。9.在10min窒息心脏停跳心肺复苏全脑缺血动物模型中应用亚低温联合静脉输入硫酸镁治疗,观察对海马CA1神经元存活的影响。结果:1.经10min窒息心脏停跳心肺复苏全脑缺血动物大鼠,常温治疗组7天存活率为17%,亚低温治疗起始于0,1,4和8小时后的7天存活率分别为45%,36%,36%和14%,起始于0,1和4小时的亚低温治疗相对于常温治疗显著地提高了生存率(P0.05)。2.亚低温治疗维持24或48小时的生存率没有统计学差异。3.亚低温治疗维持24或48小时对改善神经功能没有统计学差异(均为17%)。4.起始时间为0,1,4和8小时的亚低温治疗有良好神经功能的分别为24%,24%,19%,0%。与常温治疗组相比较,亚低温治疗起始于0,1和4小时组分别显著改善了神经功能(P0.01),三组之间没有统计学差异。5.以假手术组平均神经元数为参照,亚低温治疗起始于0,1,4和8小时的CA1区正常神经元分别为53%,53%,51%和65%,相对于仅存9%正常神经元的常温治疗组,神经元数显著增加(P0.0001)。6.相对于保存了42%正常神经元数量的24小时亚低温治疗,保存了68%正常神经元数量的48小时亚低温治疗保护了更多的神经元(P0.0001)。7.海马CA1区μ-calpain shRNA原位转染,在全脑缺血再灌注后,μ-calpain shRNA组神经元存活率显著提高(P0.05)。8.体外模拟缺血再灌注,亚低温与高浓度镁离子结合的治疗方案显著地保护了神经元(P0.05)。9.在小样本量的10min窒息心脏停跳心肺复苏全脑缺血动物大鼠模型,亚低温结合镁离子治疗保护了60.95%的海马CA1区神经元,而单纯亚低温治疗保护了44.75%的海马CA1区神经元,两组差别没有统计学意义(P=0.34)。结论:1.对心脏停跳复苏后的全脑缺血再灌注大鼠模型进行亚低温治疗,起始于0、1、4小时,以及持续治疗24和48小时的亚低温治疗均显著提高生存率。亚低温治疗起始于0、1、4和8小时,以及持续治疗24和48小时均显著增加海马CA1区存活的神经元数量,且持续治疗48小时的亚低温治疗增加神经元存活数量的作用更明显。2.对海马CA1神经元进行capn1 shRNA处理,能够降低短暂前脑缺血再灌注72小时后calpain的表达,并能够显著提高前脑缺血再灌注2周后大鼠海马CA1神经元的存活率。3.体外和在体研究显示,与亚低温治疗组相比,亚低温治疗与硫酸镁联合应用具有增加缺血再灌注后神经元存活的趋势,但在体内研究中无统计学差异。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R743

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