肠道菌群参与急性缺血性脑卒中发病机制的研究

发布时间：2020-05-27 07:16

【摘要】：在中国,脑卒中发病率高、复发率高、致死致残率高,已跃升为我国国民死因首位。根据全国范围内的人口调查,中国每年大约有240万新增脑卒中病例,每年110万与脑卒中相关的死亡,因此给国家和个人带来了巨大的经济负担。其中缺血性脑卒中也被称为脑梗死,占所有脑卒中病例的87%,它主要是因为颅内动脉的阻塞或狭窄导致血流中断所致。缺血性脑卒中的最重要病理生理机制是血管壁脂质的沉积、炎症因子的激活等一些原因导致的动脉粥样硬化。TPA(tissue-type plasminogen activator,组织型纤溶酶原激活剂)溶栓是缺血性脑卒中常用的有效治疗方法,但多数患者因未能在相应的时间窗内到达医院而失去此治疗的机会,从而导致永久的神经功能缺损。根据中国国民卒中登记统计显示,21.5%的急性缺血性脑卒中患者在发病3小时内赶到急诊科,12.6%有资格接受溶栓治疗,但只有1.6%接受了TPA静脉给药。因此,明确缺血性脑卒中动脉粥样硬化的产生机制,对预防缺血性脑卒中的发生及脑卒中发生后的治疗至关重要。然而动脉粥样硬化发生发展的基本机制复杂,学术界存在许多学说,包括炎症反应学说、脂质浸润学说、氧化应激学说、血栓形成学说、遗传学说和基因蛋白组学说等。其中以前两种学说得到广泛认可与接受。近十几年间,越来越多的研究证明微生物尤其是肠道微生物参与了动脉粥样硬化的过程。多篇流行病学研究发现微生物包括肺炎衣原体、幽门螺杆菌和牙龈卟啉单胞菌与动脉粥样硬化的发生有关。通过基因技术已在不同的患者身上,证实了人类动脉粥样硬化斑块中存在细菌DNA。其后的临床试验中发现微生物群与多种疾病的产生密切相关包括肥胖症、2型糖尿病和心血管疾病。人类与这些微生物共同进化以共生方式相处。微生物有许多生理作用包括产生必需维生素(如维生素B和维生素K)、参与碳水化合物的消化、免疫系统的建立、调节代谢包括胆固醇和脂质代谢以及产生信号分子如包括短链脂肪酸和二级胆汁酸。与此同时微生物群在包括神经系统疾病在内的许多疾病中都发挥着重要作用。多项研究已经发现肠道的微生物群可通过神经、免疫以及直接体液信号传导途径与中枢神经系统发生强烈的信号传递,中枢神经系统也可以通过调节肠道运动和分泌来改变肠道微环境,因此被称为双向脑肠信号,也就是今天我们所悉知的“脑肠轴理论”。动物和人类研究表明肠道微生物群参与自闭症、自身免疫性脑脊髓炎、视神经脊髓炎和帕金森的发病过程。肠道微生物群是否与急性缺血性脑卒中发病机制或某些危险因素相关?上述假设可进一步阐述脑肠轴的理论,也可为急性缺血性脑卒中的预防和治疗提供理论依据。国外已有一些动物实验研究发现脑卒中动物模型中肠道微生物群组成的变化。Tascillar等人报道在小鼠大脑中动脉闭塞模型中发现肠道细菌移位至肠外。Swidsinski等观察到在实验动物急性脑损伤后可出现短暂的结肠炎症和数个肠道细菌群的消失。但是,罕有关于肠道微生物群与急性缺血性脑卒中临床相关性的研究。因此肠道微生物群参与急性缺血性脑卒中发病的确切机制值得我们进一步探讨。为了探索这一机制,本课题经过严格的入排标准,选取了40例受试者(其中试验组为31例急性缺血性脑卒中患者,对照组为9例相同年龄段的健康对照组),通过粪便16S rRNA基因测序,以检测两组肠道微生物组成的差异,并用线性回归分析法和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,京都基因和基因组百科全书)分析法探讨肠道菌群与急性缺血性脑卒中危险因素的相关性。本研究主要获得如下结果:1.急性缺血性脑卒中患者组和健康对照组肠道菌群的多样性无明显差异在这项研究中,从31名急性缺血性脑卒中患者和9名健康对照者中收集了总共40份血液样本和粪便样本。两组的临床基本特征显示,急性缺血性脑卒中患者的WBC(white blood cell,白细胞)、TC(total cholesterol,总胆固醇)、TG(triglyceride,甘油三酯)和LP(a)(Lipoprotein(a),脂蛋白(a))水平显著高于健康对照组,而HDL(high density lipoprotein,高密度脂蛋白)显著低于健康对照组。另外脑卒中组中吸烟率、高血压率明显高于对照组,差异具有统计学意义。然而,微生物群落的物种总体丰富度、均匀度无统计学差异,表明两组肠道菌群的多样性没有显著性差异。2.急性缺血性脑卒中患者和健康对照组的肠道细菌的种类存在统计学差异进一步,我们对肠道微生物群的不同分类群丰度(门,纲,目,科,属和种)进行分析发现。在肠道细菌的种水平中,急性缺血性脑卒中患者和健康对照之间存在显著性差异。存在差异的三种肠道细菌分别是Blautia obeum,Streptococcus infantis和Prevotella copri。与健康对照组相比,患者组中Blautia obeum的丰度较低,而Streptococcus infantis和Prevotella copri丰度较高,差异存在统计学意义。3.异常表达的三种肠道细菌与急性缺血性脑卒中的危险因素相关在确定了三种异常表达的肠道微生物群后,我们采用线性回归分析了肠道细菌与危险因素之间是否存在相关性。Blautia obeum与WBC呈负相关,Streptococcus infantis和LP(a)呈正相关。为了预测粪便中微生物群落的基因家族和相关功能途径的丰富性,基于16S rRNA基因测序和Green基因数据库,进行了一种预测代谢方法KEGG功能途径分析。结果表明,急性缺血性脑卒中患者中许多细菌通路如脂多糖代谢、分泌功能和鞭毛装配均受到明显的调节。综上所述,本研究发现急性缺血性脑卒中患者组中有三种异常表达的细菌——Blautia obeum、Streptococcus infantis和Prevotella copri。这三种细菌可能与急性缺血性脑卒中的发生发展存在相关性,因为它们与缺血性脑卒中的危险因素和多种功能代谢途径有关。这些提示改变的肠道细菌可能参与了缺血脑卒中的发病过程,有望可以成为治疗脑血管疾病及代谢疾病的潜在靶点。
【图文】：

工作流程图,工作流程图,测序,文库

总体工作流程图

流程图,信息分析,测序,流程

南京医科大学博士学位论文17图2： Amplicon测序信息分析流程4.统计学分析用R软件（v3.1.1）绘制的分析表或柱状图总结了样本中每个分类等级（种）或OUT（可操作分类单元）。采用非参数Wilcoxon秩和检验方法对QIIME中不同组间的OTU进行了识别。在QIIME中未报告的差异，，将QIIME分析中的p<0.1的OUT:s设定为通用水平，然后使用Graphpad prim6进行统计检验。采用SPSS对分类变量进行卡方检验。组间比较p<0.05被认为具有统计学意义。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R743.3

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