LXA4对大鼠蛛网膜下腔出血后内皮损伤引起脑血流调节功能变化的影响及机制研究

发布时间：2020-05-28 15:58

【摘要】：目的:蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)主要是由颅内动脉瘤破裂引起,是神经外科的一种危重疾病,致死率高达50%,致残率高达30%。大量的SAH患者罹患继发性脑缺血和迟发性脑梗塞;迟发性脑缺血被认为是SAH患者预后较差的主要原因。当前研究则认为,SAH后脑血流自动调节受损可能是引起迟发性脑缺血的更根本的机制。脑血管内皮细胞作为血管神经网络的基本结构和功能组成成分,可以通过调节脑血管舒缩功能在脑血流自动调节中发挥关键作用。脑血管内皮细胞完整性是脑血流自动调节的前提。SAH后炎症反应可以破坏脑血管内皮细胞的完整性。脂氧素A4(lipoxin A4,LXA4)是机体内重要的内源性脂质抗炎和促炎症消退介质,已证实能抑制SAH后中性粒细胞的聚集与粘附。在本研究中,通过构建大鼠实验性SAH模型,研究LXA4对脑血管内皮功能的保护作用以及探讨其在SAH后脑血流调节中的作用,并初步探讨其潜在的机制,为临床SAH的治疗提供新思路。方法:1、选用SD雄性大鼠,使用血管内穿刺法构建假手术和SAH模型,在SAH后通过激光多普勒血流仪监测大鼠脑血流(Cerebral blood flow,CBF)的变化。抽取各组大鼠动脉血液标本,流式细胞仪用于检测血液中内皮微粒的表达水平。利用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测SAH后脑血管中LXA4的含量,明确内皮功能损伤最严重的时间点以及LXA4在血管中表达的差异。2、构建SD大鼠颈内动脉穿刺SAH模型,在内皮损伤最严重时间点,通过侧脑室注射外源性LXA4和生理盐水对照,使用改良的神经功能Garcia评分检测大鼠神经功能的变化。通过检测Evans Blue(EB)的渗出率来观察SAH后血脑屏障(Blood brain barrier,BBB)通透性的变化,使用脑组织干湿重法检测脑水肿的变化。利用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测炎症因子(TNF-α,IL-1β,IL-6)的表达水平。使用NO试剂盒检测NO的表达水平,免疫荧光双标检测中性粒细胞和血管内皮细胞的相互浸润情况。取大脑Willis环和基底动脉提取组织蛋白,Western Blot检测FPR2、NF-κB、MMP-9、MPO及ICAM-1蛋白的表达。多普勒血流仪检测LXA4干预后大鼠脑血流的变化。3、血管内穿刺法构建SD大鼠SAH模型,并通过侧脑室注射FPR2siRNA,Western Blot检测FPR2、NF-κB、MMP-9、ERK1/2、MPO和ICAM1的表达,多普勒激光散斑用于检测大鼠脑皮层血流的变化,探讨LXA4影响SAH后脑血流变化的可能机制。结果:1、大鼠SAH后血液中内皮微粒表达水平在6h后逐渐升高,并在24h达最高水平,并在48h和72h维持高水平,结果表明SAH后24h是内皮损伤最严重时间点。ELISA检测结果显示,SAH后血管中LXA4表达水平下降,24h表达最低。后续实验则以24h为观测时间。2、大鼠SAH模型构建成功后24h发现BBB破坏明显,且伴有严重的脑水肿和脑皮层血流量的减少并可见明显的神经功能障碍。外源性LXA4的干预处理后,观察到其明显缓解BBB通透性的破坏,减轻脑水肿,促进脑血流的恢复,改善大鼠SAH后神经功能。而使用LXA4受体FPR2的siRNA干预后上述改善症状消失。3、免疫荧光检测中性粒细胞标记物(MPO)和血管内皮细胞标记物(VWF)共染情况,结果发现SAH后24h后血管MPO与内皮细胞相互浸润,提示炎症参与了内皮损伤过程。同时SAH后24h血液中TNF-α,IL-1β,IL-6的表达水平明显增高,经LXA4干预后,炎症因子的表达受到抑制,中性粒细胞与内皮细胞的相互浸润得到缓解。4、LXA4干预后降低了血液中内皮微粒的表达水平,恢复了降低的NO水平,减轻了内皮功能障碍。同时在Hb刺激脑血管内皮模型发现,内皮细胞活力下降,但LXA4对其有保护作用,可以恢复细胞活力。5、Western Blot检测发现LXA4抑制了SAH后血管的NF-κB、MMP9、ICAM1及MPO的表达,以及抑制了ERK1/2的磷酸化水平;LXA4处理后FPR2表达水平增高,FPR2 siRNA干预后部分消除了LXA4的这些作用。结论:1、大鼠SAH后内皮功能受损明显,并在24h最严重。同时发现大鼠脑皮层血流在SAH后较术前明显降低。2、LXA4能够缓解BBB通透性的破坏,减轻脑水肿,促进脑血流的恢复,改善大鼠SAH后神经功能。3、LXA4促进SAH后脑皮层血流的恢复,可能与抑制中性粒细胞对内皮细胞的浸润,减轻血管炎症,缓解内皮功能障碍有关。4、LXA4的保护作用可能通过FPR2/ERK1/2/NF-κB通路实现。
【图文】：

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图 1 大鼠颅底照片。A：Sham 组；B：SAH 组Fig.1. Figure shows representative pictures of sham and SAH图 2 大鼠 SAH 后 ICP 和 MABP 的变化Fig. 2. Time course of ICP and MABP after SAH in rats

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图 1 大鼠颅底照片。A：Sham 组；B：SAH 组Fig.1. Figure shows representative pictures of sham and SAH
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R743.35

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