DNA甲基化和miRNA对缺血性脑卒中患者外周血ALOX5AP基因表达的调控机制研究

发布时间：2020-06-02 12:56

【摘要】：研究背景与目的:缺血性脑卒中(Ischemic Stroke,IS)是由于脑动脉管腔狭窄或阻塞,导致灌流区的脑组织缺血、缺氧或坏死为主要临床表现的一种神经系统疾病。我国是IS的高发国家,其具有高发病率、高致残率及高死亡率的特点。IS发生的一个重要病理生理学基础是动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)的形成及发展,而炎症在AS发生过程中起关键作用。5-脂氧合酶激活蛋白/5-脂氧合酶(5-lipoxygenase activating protein/5-lipoxygenase,FLAP/5-LO)通路是炎症介质白三烯(Leukotriene,LT)代谢的重要环节,在白三烯生物合成早期起重要作用。5-脂氧合酶激活蛋白基因(5-lipoxygenase activating protein,ALOX5AP)编码合成FLAP蛋白,FLAP和5-LO结合调节LT的生物合成,进而激活中性粒细胞和单核细胞,增加血管内壁的黏附和通透性,参与AS的发展进程,与IS的发生密切相关。Str?m等研究发现敲除ALOX5AP基因的小鼠,其体内LT的生物合成受到显著抑制,减缓了缺血性脑损伤的发生。许晓伟等在动物水平评价了ALOX5AP基因mRNA的表达水平与脑卒中的关系,结果表明ALOX5AP基因的过表达与高血压性脑卒中存在相关性。本课题组前期应用荧光定量PCR技术对40例IS患者与40例对照者外周血中ALOX5AP基因的mRNA表达水平进行了初步检测与分析,结果发现IS病例组外周血中ALOX5AP基因的mRNA表达水平显著高于对照组。由此,我们推测IS患者外周血中ALOX5AP基因的mRNA表达水平高于对照组,并可能通过参与动脉壁的炎症反应介导IS的发生。表观遗传学的兴起为揭示基因的表达调控机制提供了新思路,它是指在基因组DNA序列不发生改变的情况下,基因的表达发生了可遗传的改变。DNA甲基化(DNA methylation)是表观遗传调控的重要形式之一,它是指在DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)的作用下,将甲基基团添加在基因组DNA分子胞嘧啶上,形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-mC)。通常认为,DNA甲基化会阻碍转录因子与顺式作用元件的结合,从而抑制基因的表达。然而,ALOX5AP基因启动子区甲基化对IS患者外周血ALOX5AP基因表达的影响尚不清楚。此外,位于CpG位点上的SNP称为CpG-SNP,它可以增加或去除相应的CpG位点,导致等位基因特异性甲基化(allele-specific methylation,ASM)的现象,对基因的表达产生影响。然而,ALOX5AP基因启动子区CpG-SNPs能否通过ASM影响DNA甲基化进而影响基因的表达有待进一步探讨。微小RNA(microRNA,miRNA)是真核生物细胞内一类具有调控功能的非编码RNA,主要通过结合靶基因mRNA的3’端非翻译区(3’UTR),降解mRNA或者阻碍蛋白质的翻译过程,进而下调靶基因的表达水平。然而IS患者外周血血浆中某些特定的miRNAs是否影响了IS患者外周血ALOX5AP基因的表达目前尚不清楚。综上所述,本课题提出如下假说:ALOX5AP基因启动子区的DNA甲基化及miRNA调控等表观遗传机制可能影响了IS患者外周血ALOX5AP基因的表达,并通过参与动脉壁的炎症反应介导了IS的发生。本研究将揭示DNA甲基化及miRNA对IS患者外周血ALOX5AP基因表达的影响,为IS发生的遗传学机制及人群防治提供新的理论依据。研究对象:研究方案已经通过郑州大学、郑州市第一人民医院、郑州大学第一附属医院及河南中医药大学第一附属医院伦理委员会批准,所有受试者均为河南汉族人群,并且均签署了知情同意书。1.检测ALOX5AP基因mRNA表达的研究对象病例组为2016年4月至2017年7月在郑州市第一人民医院及郑州大学第一附属医院神经内科住院的IS患者150例,其中男性95例,女性55例,平均年龄60.76±12.83岁。所有患者的诊断均依据WHO所制定的IS诊断标准,并经过了各项检查(病史、体征、临床生化检验、CT或MRI)确诊。对照组为同期性别、年龄与病例组相匹配且无心脑血管疾病的健康体检个体150例,其中男性80例,女性70例,平均年龄60.83±13.44岁。2.检测ALOX5AP基因启动子区甲基化的研究对象研究对象同检测ALOX5AP基因mRNA表达的研究对象。3.检测血浆miRNA表达的研究对象病例组为2016年4月至2017年7月在郑州市第一人民医院及河南中医药大学第一附属医院神经内科住院的IS患者50例,其中男性30例,女性20例,平均年龄62.42±13.04岁。所有患者的诊断均依据WHO所制定的IS诊断标准,并经过了各项检查(病史、体征、临床生化检验、CT或MRI)确诊。对照组为同期性别、年龄与病例组相匹配且无心脑血管疾病的健康体检个体50例,其中男性28例,女性22例,平均年龄58.80±13.66岁。研究方法:1.采用天根公司的高效血液总RNA提取试剂盒提取RNA,并对其进行反转录,应用荧光定量PCR技术对外周血中ALOX5AP基因的mRNA表达水平进行检测与分析。2.采用天根公司的血液基因组提取试剂盒提取DNA,通过MethylTarget目的区域甲基化测序的方法对ALOX5AP基因启动子区的Cp G位点进行DNA甲基化水平的检测与分析。3.应用KASP基因分型技术对CpG-SNP rs4073259位点进行基因分型,并比较不同基因型个体间DNA甲基化水平及ALOX5AP基因mRNA表达水平之间的差异。4.双荧光素酶报告基因的实验方法检测不同等位基因转录活性的差异。5.采用天根公司的血浆miRNA提取分离试剂盒提取血浆miRNAs,并对其进行反转录,应用荧光定量PCR技术对外周血血浆中miR-335及miR-495的表达水平进行检测与分析。6.双荧光素酶报告基因的实验方法探讨miR-335、miR-495结合ALOX5AP基因的3’UTR区。7.本研究实验数据采用SPSS 21.0软件进行分析。所有定量资料均以均数±标准差的形式来表示,两组之间的定量资料采用两独立样本t检验的方法进行分析,三组之间的定量资料采用单因素方差分析的方法进行分析,两组之间的定性资料采用χ~2检验的方法进行比较。检验水准α=0.05,P0.05具有统计学意义。结果:1.IS病例组ALOX5AP基因的mRNA表达水平显著高于对照组(P0.05)。2.IS病例组ALOX5AP基因启动子区的平均甲基化水平与对照组之间无明显差异(P0.05),性别分层分析发现两组之间也无明显差异(P0.05)。3.CpG-SNP rs4073259在CpG8位点处呈现了ASM的现象,并且启动子区甲基化水平较高的GG基因型个体ALOX5AP基因的mRNA表达水平显著低于AG和AA基因型个体(P0.05)。4.用于检测不同等位基因转录活性差异的双荧光素酶报告基因实验结果表明,携带CpG-SNP rs4073259位点G等位基因重组质粒的相对荧光活性显著低于携带A等位基因重组质粒的荧光活性(P0.05)。5.IS患者血浆中miR-335、mi R-495的表达水平显著低于对照组(P0.05)。6.用于探讨miRNA与ALOX5AP基因关系的双荧光素酶报告基因实验结果表明,miR-335、miR-495可以结合ALOX5AP基因的3’UTR区,调控该基因的表达。结论:1.IS病例组外周血中ALOX5AP基因的mRNA表达水平显著高于对照组(P0.05)。2.ALOX5AP基因启动子区CpG-SNP位点rs4073259通过ASM影响了该基因的表达,从而影响了疾病的表型。3.miR-335、mi R-495在IS患者外周血血浆中表达下降,并通过结合ALOX5AP基因的3’UTR区调控该基因的表达。
【图文】：

通路图,白三烯,炎症介质

图 1.1 炎症介质白三烯代谢通路图发现敲除 ALOX5AP 基因的小鼠，其体了缺血性脑损伤的发生。许晓伟等[1NA 的表达水平与脑卒中的关系，结果表卒中存在相关性。本课题组前期应用荧例对照者外周血中 ALOX5AP 基因的 mR现 IS 组外周血中 ALOX5AP 基因的 mR[13]。（图 1.2）因此，我们推测 IS 患者水平高于对照组，并可能通过参与动脉

外周血,表达水平,对照组,基因

图 1.1 炎症介质白三烯代谢通路图[11]研究发现敲除 ALOX5AP 基因的小鼠，，其体内 LT减缓了缺血性脑损伤的发生。许晓伟等[12]在动 mRNA 的表达水平与脑卒中的关系，结果表明 AL压性脑卒中存在相关性。本课题组前期应用荧光定与 40 例对照者外周血中 ALOX5AP 基因的 mRNA 表结果发现 IS 组外周血中 ALOX5AP 基因的 mRNA 表<0.05）[13]。（图 1.2）因此，我们推测 IS 患者外周表达水平高于对照组，并可能通过参与动脉壁的炎
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R743.3

【参考文献】