胶质瘤中启动子甲基化和转录因子Sp1对MAGE-D4的转录调控作用

发布时间：2020-06-02 14:44

【摘要】：目的:探讨MAGE-D4启动子甲基化和转录因子Sp1对MAGE-D4启动子活性的影响。方法:1.生物信息学分析:通过公共数据库查询分析MAGE-D4启动子区域及转录因子结合位点,MAGE-D4/Sp1表达及相关性等。2.甲基化质谱分析:提取50例胶质瘤组织和9例正常脑组织DNA,检测MAGE-D4启动子区域CpG位点甲基化水平。3.荧光素酶报告基因质粒构建:根据生物信息学分析结果,构建5个不同截短MAGE-D4启动子荧光素酶报告基因载体(pGL3-P1~P5)。4.荧光素酶活性检测(Luciferase assay):将构建好的pGL3-P1~P5转染细胞,检测荧光素酶活性,筛选MAGE-D4核心启动子区域;用已筛选出的pGL3-p进行后续相关实验。5.实时荧光定量PCR(qRT-PCR):提取细胞总RNA,将RNA逆转录为cDNA,cDNA经管家基因扩增检测质量后,用于检测Sp1 mRNA和MAGE-D4 mRNA。6.蛋白质印迹法(Western Blot):提取细胞核蛋白,用于检测Sp1蛋白表达。7.染色质免疫共沉淀-qPCR(ChIP-qPCR):Sp1抗体富集DNA/Sp1蛋白复合物,然后qRT-PCR扩增,检测Sp1与MAGE-D4启动子的结合。结果:1.生物信息学分析显示,MAGE-D4启动子序列具有Sp1等多个转录因子结合位点,其相对核心启动子区域含4个Sp1潜在结合位点并与甲基化位点重合;胶质瘤中MAGE-D4和Sp1表达较高,正常组织中表达较低,二者具有一定的共表达相关性。2.MAGE-D4核心启动子区域的确定:通过构建5个不同截短MAGE-D4启动子报告基因载体,进行荧光素酶报告基因载体活性检测,筛选出-358~+172 bp区域为MAGE-D4基因的相对核心启动子。3.质谱分析结果显示,胶质瘤样本中MAGE-D4启动子区域平均总体甲基化频率低于正常脑组织样本。4.Luciferase assay结果显示,启动子甲基化降低MAGE-D4启动子活性。5.Luciferase assay和qRT-PCR结果显示,Sp1能够增强MAGE-D4启动子活性并促进MAGE-D4转录。6.ChIP-qPCR证实Sp1直接结合于MAGE-D4启动子区域;DAC处理胶质瘤细胞株后,能提高Sp1与MAGE-D4启动子的结合能力。7.Luciferase assay结果显示,非甲基化的MAGE-D4启动子,再转染pcDNA-Sp1,报告基因载体显示出相对最高的启动子活性,提示Sp1和去甲基化存在协同作用共同提高了MAGE-D4启动子活性。结论:1.MAGE-D4相对核心启动子区域为-358~+172 bp;2.MAGE-D4启动子活性与其甲基化状态有关;3.转录因子Sp1能活化MAGE-D4启动子并促进其转录;4.去甲基化和Sp1协同提高MAGE-D4启动子活性。
【图文】：

中启动子甲基化和转录因子 Sp1 对 MAGE-D4 的转录调控作用 2018 届硕士-TK 质粒（Promega 公司）结构如图 1-2 所示；pRL-TK酶基因序列，，用于 pGL3-Basic 质粒的实验对照。

pRL-TK质粒示意图
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.4

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本文编号：2693314