一腓骨肌萎缩症家系致病基因NEFH的分离鉴定及致病机制研究

发布时间：2020-06-04 11:57

【摘要】：研究背景腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth disease,CMT)是最常见的周围性神经变性病之一,亦称为遗传性运动感觉神经病,人群患病率为1/2500。CMT具有高度的临床以及遗传异质性,其典型的临床表现是对称性肢体远端肌无力与肌萎缩、异常步态、鹤腿样畸形、弓形足、锤状趾以及深腱反射减弱或消失,有时感觉功能也会受累。根据神经电生理特点,CMT可分为脱髓鞘型和轴索型:脱髓鞘型,即 CMT1 型,运动神经传导速率(Motor nerve conduction velocity,MNCV)明显降低,一般小于38m/s,且伴有脱髓鞘病变;轴索型,即CMT2型,MNCV正常或接近正常,伴随轴突退行性变;MNCV位于35-45 m/s之间的患者被称为中间型。CMT遗传方式多样,可呈常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传,也可呈X连锁遗传。根据遗传方式及致病基因/位点不同,CMT又可分为不同的亚型,各亚型的临床表现不尽相同。随着高通量测序技术的发展,迄今为止,已发现70多个基因/位点的突变与CMT的发生有关。外周神经系统中最主要的两种组分是神经元及包裹在神经元轴突外面的髓鞘,而髓鞘膜的形成及结构的维持有赖于施万细胞正常功能的发挥。某些致病基因突变后会导致蛋白质发生错误折叠,并在内质网出现异常聚集,引起未折叠蛋白反应,从而促进了施万细胞的凋亡增加,出现脱髓鞘病变,最终导致CMT的发生。另外,施万细胞还可以为神经元提供营养支持,对于神经元结构的维持及功能的发挥也具有重要的作用,所以当外周神经发生脱髓鞘病变后会继发轴突结构异常及功能缺失,即轴突变性。相比脱髓鞘本身而言,轴突变性与疾病的临床表现具有更加密切的联系。某些致病基因突变后会直接影响轴突的发育或者正常的轴突运输,从而引起轴突退行性变,导致疾病的发生。神经丝(Neurofilaments,NFs)是一种直径为10nm的中间丝。根据分子量的大小,可分为神经丝蛋白轻链(Neurofiilament light chain,NEFL)、神经丝蛋白中链(Neurofilament medium chain,NEFM)及神经丝蛋白重链(Neurofilament heavy chain,NEFH)。神经丝蛋白在神经元胞体内形成,随后运输至轴突,与微管蛋白等其他细胞骨架蛋白装配形成纤维网状结构,其对于轴突的生长、轴突直径的维持以及电冲动沿轴突的传导具有非常重要的作用。有研究证实,NEFL基因突变后会导致神经丝在胞体发生异常聚集,破坏正常网状结构的形成,引起轴突运输障碍及轴突退行性变,最终导致CMT2E的发生。NEFM中的变异与帕金森病(Parkinson's disease,PD)的发生有关。此外,NEFH基因突变后会导致肌萎缩性侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS),也是一种常见的退行性神经病。综上,神经丝网状结构的正常装配对于轴突的发育及运输功能意义重大,编码神经丝蛋白的基因发生突变后会引起轴突变性最终导致多种神经退行性疾病的发生。研究目的1.对采集到的一常染色体显性遗传的CMT家系致病基因进行分离;2.在体外及体内水平进行验证,明确突变的致病机制。研究方法1.将该CMT家系中所有成员进行全基因组扫查,其中两个患者进行全外显子组测序;2.构建野生型及突变型NEFH病毒表达载体,构建稳定高表达野生型及突变型NEFH的细胞系。利用免疫荧光检测细胞中神经丝分布情况。3.利用吗啉反义寡核苷酸(Morpholino antisense oligonucleotides,MOs)构建nefh knockdown斑马鱼模型,对胚胎的大体形态及运动能力进行观察,利用免疫组化及免疫荧光检测神经元轴突发育情况。构建pCS2-NEFH以及pCS2-NEFH-Mut真核表达载体,线性化后体外转录获得人野生型及突变型NEFH mRNA,与nefh MOs共注射,观察斑马鱼胚胎表型。4.构建人突变型NEFH转基因小鼠模型以及突变型Nefh knock-in小鼠模型。利用转棒实验、跑台实验及握力实验进行行为学检测。对小鼠的电生理特征进行检测,包括神经传导速率与复合肌肉动作电位。利用HE染色进行肌肉病理检测。利用透射电镜对突变型Nefh knock-in小鼠坐骨神经进行组织学分析。结果1.一腓骨肌萎缩症家系致病基因NEFH的分离鉴定我们采集到一 CMT家系,该家系一共三代,每一代都出现发病患者,而且男女均有发病,呈常染色体显性遗传,临床诊断为CMT2型。该家系中有7名患者,10名正常人。患者大多为20岁左右发病,典型表现是下肢出现肌萎缩和肌无力、腱反射减弱或消失并逐渐累及上肢、足部畸形即出现弓形足,但感觉功能未受累。为了分离该家系的致病基因,我们首先排除了已知的CMT致病基因,然后利用Illumina SNP芯片对家系中所有成员进行全基因组扫查,对常染色体上872,261个单核苷酸多态位点(Single nucleotide polymorphism,SNP)进行基因分型。结果发现,在2号染色体171204750-173914775和22号染色体28866225-36418280区域得到大于2的LOD值,提示连锁,最大LOD值分别为2.3543和2.3541,其他染色体均未出现LOD值大于2的区域,这提示该家系的致病基因位于以上两个连锁区域内。随后,我们分别对这两个候选区域进行了单体型分析,发现与家系中患者的表型共分离。与此同时,我们选取了亲缘关系较远的两个患者进行了全外显子组测序(Whole-exome sequencing,WES)。我们将两个患者共有且位于以上连锁区域内的变异作为候选突变。结果发现,2号染色体连锁区域不存在符合条件的变异,而22号染色体则包含四个候选变异,分别是NEFH(c.1937_1938insAAGTCCCCTGAGAAGGCC)、NEFH(c.2229_2248delGCTAAGTCCCCAGAGAAG)、NEFH(c.3057insG)以及APOL6(c.824 CA)。经比对,以上突变均不存在于千人基因组计划数据库中。但是,NEFH中第一个候选变异为纯合突变,而该CMT家系呈常染色体显性遗传,故予以排除;NEFH中第二个候选变异在外显子集合数据库(Exome Aggregation Consortium,ExAC)中为多态位点;而且ExAC数据库中包含APOL6(c.824 CA)的突变,根据其变异频率与疾病发生率并不相符,同样予以排除。这提示NEFH(c.3057insG)最可能为该CMT家系的致病基因。随后,我们利用Sanger测序在家系其他成员中进行了检测,结果表明,该插入突变在家系中与表型共分离,即患者均携带该位点的突变而正常人均不携带。综上所述,我们将该常染色体显性遗传CMT家系的致病基因初步确定为NEF(c.3057 ins G,p.Lys 1020Glufs*43)。神经丝主要在神经元胞体内合成,然后沿轴突运输至远端。正常情况下,在外周神经系统,NEFL、NEFM、NEFH和外周蛋白会装配形成神经丝网状结构,这对于细胞骨架的维持及轴突的生长具有非常重要的作用。研究表明,NEFL发生突变后会引起神经丝蛋白在胞体内发生异常聚集,不能运送至轴突远端,正常网状结构遭到破坏,引发轴突变性,最终导致CMT的发生。此外,NEFH突变会引起神经元胞体出现异常淀粉样聚集,是肌萎缩性侧索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS)典型的病理改变。近期研究发现,NEFH发生移码突变导致终止密码子缺失,3'UTR中延长的氨基酸会编码与ALS病理改变相似的纤维淀粉样物质CAEs(cryptic amyloidogenic elements),引起突变型蛋白在胞质出现异常聚集。为了进一步明确突变型NEFH的功能及其致病机制,我们构建了野生型及突变型NEFH慢病毒表达载体。为了避免内源性神经丝的干扰,我们选择不表达内源性神经丝的SW13(vim-)细胞进行病毒感染,利用嘌呤霉素筛选得到稳定高表达野生型或者突变型NEFH的细胞系。由于NEFH必须与NEFL结合才能装配形成直径10 nm的神经丝,所以我们将野生型NEFL表达载体瞬时转染入稳定高表达野生型或突变型NEFH的SW13(vim-)细胞中。转染48小时后,利用NEFH特异性抗体进行标记,通过免疫荧光实验检测神经丝的表达。结果发现,在稳定高表达野生型NEFH的细胞中,绿色荧光在胞质中均匀弥散分布,而高表达突变型NEFH的细胞中出现了绿色荧光的聚集,与之前的研究发现一致,这提示突变型NEFH的表达可能引起突变型蛋白的异常聚集,破坏了神经丝网状结构的形成以及正常功能的发挥,从而导致疾病发生。2.利用斑马鱼模型明确突变型NEFH的致病性斑马鱼的神经系统在短时间内就可以发育完全而且较易观察,所以常被作为模式动物对神经退行性疾病的致病机制进行研究。因此,我们针对nefh第二外显子和第一内含子的剪接位点设计了吗啉反义寡核苷酸(Morpholino antisense oligonucleotides,MOs),将其显微注射至1～2细胞期斑马鱼胚胎中构建了nefh-knockdown斑马鱼模型。以存在5个错配碱基的control MO作为对照,在受精后48小时观察胚胎表型是否出现改变。结果发现,显微注射1 pmol control MO的斑马鱼胚胎表型与野生型相比没有明显差异,而显微注射等量的nefh MOs的胚胎出现了尾部发育畸形,表现为不同程度地弯曲。由于CMT患者的典型临床表现是双下肢对称性肌萎缩、无力,所以我们对受精后48小时的斑马鱼胚胎的运动能力,即触碰诱发的游泳运动进行了检测。野生型及显微注射control MO的胚胎对于触碰十分敏感,引发快速游泳运动,而注射nefh MOs的胚胎对触碰不敏感甚至完全没有反应,运动能力显著下降,提示nefh敲低后斑马鱼胚胎的运动能力受到损害。神经丝对于运动神经元轴突的发育起到关键作用,CMT2型患者典型的病理表现是轴突变性,所以我们利用Znp-1特异性抗体对受精48小时胚胎的运动神经元轴突进行标记检测。结果发现,显微注射control MO的胚胎神经元轴突从背侧发出,垂直延伸至腹侧,而注射mefh MOs的胚胎运动神经元轴突发育异常,出现截短或者分叉的现象,甚至完全不发育。随后我们利用乙酰化α-tubulin抗体进行斑马鱼全胚免疫荧光检测也观察到了同样的结果,提示nefh的缺失影响了运动神经元轴突的生长从而导致了胚胎运动能力的降低。以上结果仅能证明NEFH对运动神经元具有作用,但并不能验证NEFH(p.Lys1020Glufs*43)具有致病效应,为了明确NEFH的突变是否具有致病性,我们将人野生型NEFH mRNA与nefh MOs共同显微注射入1～2细胞期斑马鱼胚胎中进行拯救实验。结果发现,胚胎的表型完全或者部分恢复正常,出现尾部畸形的胚胎比例明显降低,而且胚胎运动神经元轴突发育部分恢复正常,出现截短或分叉的轴突比例显著降低,这提示人野生型NEFF mRNA能够代偿内源性nefh的缺失。但是,人突变型NEFH mRNA与nefh MOs共注射的胚胎仍然会出现尾部发育畸形,而且与单独注射nefh MOs的胚胎相比,出现轴突生长缺陷,即轴突截短或分叉的胚胎比例并没有出现降低,这表明人突变型NEFH mRNA不能拯救内源性nefh缺失所引起的异常表型,也证实了突变型NEFH的致病性。这进一步证实了NEFH发生突变后会影响运动神经元轴突的发育及正常功能的发挥,从而引起轴突变性,导致神经退行性疾病的发生。3.利用小鼠模型对NEFH致病机制的研究为了进一步探讨NEFH突变的分子病理效应,我们构建了人突变型NEFH(mNEFH)转基因小鼠模型。首先,我们通过转棒实验对小鼠的行为学进行检测,结果发现,与野生型(wild-type,WT)小鼠相比,人mNEFH转基因小鼠并没有出现运动能力的降低。随后,我们利用握力实验对小鼠的肌力进行检测,结果发现,转基因小鼠也没有出现肌无力等典型的神经退行性病变。转基因小鼠的MNCV与野生型小鼠相比没有出现降低,而且复合肌肉动作电位(Compound muscle action potential,CMAP)振幅及时程也没有明显改变。此外,肌肉病理检测结果显示,转基因小鼠的腓肠肌肌纤维排列整齐,没有出现形态异常或者肌肉萎缩。综上结果表明,人mNEFH转基因小鼠没有出现类似于CMT患者或者其它动物模型所表现的退行性改变。随后,我们又构建了突变型Nefh(mNefh)knock-in小鼠模型。行为学检测发现mNefh knock-in杂合小鼠运动能力与野生型小鼠没有明显差异,而且肌力正常。电生理检测表明,mNefh knock-in杂合小鼠MNCV没有出现降低,且CMAP振幅和时程均正常。肌肉病理检测显示腓肠肌肌纤维排列正常,没有出现萎缩或肥大以及CMT典型的核固缩现象。除此之外,透射电镜检测提示mNefh knock-in杂合小鼠坐骨神经神经元轴突数量减少,但轴突直径分布正常,神经丝密度并未出现明显降低,轴突直径与纤维直径之比(g-ratio)也无异常改变。尽管斑马鱼中内源性nefh的缺失能够引起运动神经元轴突变性,但是两种小鼠模型没有表现出明显的神经退行性疾病的典型症状。这与之前Nefh基因敲除小鼠模型并未有明显的临床表型是一致的,可能与疾病发病年龄较晚以及疾病的异质性有关系。创新性和意义本研究发现了 NEFH中一新的突变位点,其可以引起神经丝发生异常聚集,不能形成正常的网状结构,从而导致CMT2CC的发生,进一步揭示了 CMT的发病机制,为疾病的基因诊断奠定了基础。
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ＰＣＲ邋（Ｌｉｇａｔｉｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ邋ＰＣＲ，，ＬＭ－ＰＣＲ）对纯化的邋ＤＮＡ邋进行扩增。利用邋Ａｇｉｌｅｎｔ逡逑２１００液相分析系统对捕获的外显子区域ＤＮＡ进行富集，然后在Ｈｉｓｅｑ２０００平台逡逑进行高通量测序，操作流程如图１－２。根据以下条件对得到的突变位点进行筛选：逡逑①突变必须为杂合突变；②ＭＡＦ小于０．０５％；③ＩＩＩ４和ＩＩ１均携带。逡逑３３逡逑

ＩＩＭ逡逑候选区域逡逑图１－１全基因组扫查逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ邋ｓｃａｎｎｉｎｇ逡逑２．４全外显子组测序逡逑将家系中ＩＩＩ４和ＩＩＩ的ＤＮＡ样本送至华大基因进行全外显子组测序。将纯化的逡逑基因组ＤＮＡ样本随机打断，片段长度主要在１５０邋ｂｐ－２００邋ｂｐ之间。通过连接介导逡逑ＰＣＲ邋（Ｌｉｇａｔｉｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ邋ＰＣＲ，ＬＭ－ＰＣＲ）对纯化的邋ＤＮＡ邋进行扩增。利用邋Ａｇｉｌｅｎｔ逡逑２１００液相分析系统对捕获的外显子区域ＤＮＡ进行富集，然后在Ｈｉｓｅｑ２０００平台逡逑进行高通量测序，操作流程如图１－２。根据以下条件对得到的突变位点进行筛选：逡逑①突变必须为杂合突变；②ＭＡＦ小于０．０５％；③ＩＩＩ４和ＩＩ１均携带。逡逑３３逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R746.4


本文编号：2696355