GSK-3β-SIRT2通路在6-OHDA诱导的帕金森病神经元死亡中的作用

发布时间：2020-06-07 09:49

【摘要】：帕金森病(Parkinson Disease,PD)是第二大常见的神经变性病,黑质致密部(substantia nigra pars compacta,SNpc)多巴胺能神经元丢失是PD的病理特征。PD严重影响患者的生活质量、家庭和社会负担。PD在全球影响了65岁以上人群中1%人口。PD治疗目前仍以药物为主,但这些药物只能改善或减轻患者临床症状,不能延缓、阻止、甚至是逆转PD的病程。所以寻找能减缓、阻止、逆转PD患者病程的药物对PD治疗非常重要。研究证实PD中GSK-3β被激活,GSK-3β Ser9磷酸化(p-GSK-3β Ser9)水平降低——致α-synuclein表达增加和聚集形成包涵体并下调抗凋亡因子Bcl-2和上调GSK-3β表达,细胞最终死亡。SIRT2是NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶,主要位于胞浆。在PD模型中抑制SIRT2能减少α-synuclein数量、调节α-synuclein寡聚体大小、降低α-synuclein毒性;改善PD小鼠运动能力、阻止纹状体多巴胺(Dopamine,DA)和黑质酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)阳性(TH+)神经元减少、提升还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)和降低丙二醛(Malondialdehyde,MDA)水平、降低Caspase-3活性等神经保护作用。但是SIRT2的活性在PD模型中是否有变化,其活性是如何被调控的,尚未有报道,因此我们首次在PD细胞模型中研究SIRT2的活性是否被GSK3β调控以及是如何被GSK3β调控。首先建立6-羟基多巴(6-OHDA)的SH-SY5YPD细胞模型,确定1100μM 6-OHDA处理4h致细胞显著死亡。接着我们用Western Blotting检测到6-OHDA处理SH-SY5Y细胞和原代皮层神经元中p-GSK-3β Ser9水平显著降低,提示GSK-3β被激活;细胞内SIRT2总表达水平未变化,但胞核内SIRT2表达水平升高。接着我们利用免疫沉淀技术得到6-OHDA处理的SH-SY5Y细胞核内SIRT2并检测其活性,发现PD细胞模型胞核内SIRT2活性显著升高,而GSK-3β抑制剂SB216763能逆转其活性升高。上述研究证实6-OHDA细胞模型中GSK-3β活性升高,虽未改变SIRT2表达水平,但胞核SIRT2表达及活性显著升高。接着我们检测GSK-3β是否磷酸化修饰SIRT2。我们构建SIRT2带GST(pGEX-4T-3)标签的质粒,融合表达后与GST-Beads结合得到SIRT2纯化蛋白,再用GSK-3β激酶和SIRT2、ATP、32P-y-ATP反应,进行磷酸激酶实验,反应产物电泳后行放射自显影检测证实GSK-3β能磷酸化SIRT2,质谱鉴定GSK-3β磷酸化SIRT2的具体位点为SIRT2 Ser327,331,335。再以GST-SIRT2质粒为模板构建GST-SIRT2S327A、GST-SIRT2S331A、GST-SIRT2S335A点突变质粒,融合表达获得蛋白。GSK-3β激酶体外磷酸化SIRT2点突变蛋白,放射自显影检测证实GSK-3β磷酸化SIRT2点突变蛋白水平明显降低。证实GSK-3β能磷酸化修饰SIRT2,初步建立GSK-3β和SIRT2之间的联系。过表达GSK-3β和SIRT2后免疫共沉淀结果提示其在SH-SY5Y细胞内能相互结合。在PD细胞模型中,免疫沉淀SIRT2后,Western Blotting检测显示SIRT2磷酸化水平显著升高,GSK-3β抑制剂SB216763逆转6-OHDA诱导的SIRT2磷酸化水平升高。在PD细胞模型中,6-OHDA致还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平显著降低、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)水平显著升高;SB216763和sh-RNA敲减SIRT2(sh-SIRT2)表达均能提升GSH和降低MDA水平。本研究发现:1.PD细胞模型中GSK-3β活性增高;2.PD细胞模型内总SIRT2水平未改变,但胞核内SIRT2水平升高;SIRT2磷酸化水平显著升高,其在细胞核内活性升高;3.GSK-3β在6-OHDA细胞模型中磷酸化SIRT2,并促进其在细胞核内活性升高;4.6-OHDA细胞模型内,SIRT2活性升高,提高细胞内氧化应激水平而导致神经毒性作用。
【图文】：

载体,图谱,片段,网站

（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ＿ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＮＭ＿０１２２３７．３），然后将其邋ＣＤＳ邋区片段到逡逑ＮＥＢ网站（ｈｔｔｐ：／／ｎｃ２．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ＮＥＢｃｕｔｔｅｒ２／）查询酶切位点，我们选择不能酶切逡逑ＳＩＲＴ２片段的酶，然后再根据ｐＧＥＸ－４Ｔ－３上的多克隆位点（图２），根据酶的酶逡逑切效率，最终选择ＢａｍＨＩ和Ｓａｉｌ作为双酶切位点（即ＢａｍＨＩ和Ｓａｉｌ是ｐＧＥＸ－４Ｔ－３逡逑上的酶切位点，而不能酶切ＳＩＲＴ２的ＣＤＳ区片段）。逡逑１５逡逑

磷酸化,磷酸化反应,细胞模型,软件预测

逦６－ＯＨＤＡ逦６－ＯＨ邋Ｄ邋Ａ＋ＳＢ２１６７６３逡逑图７．邋ＳＢ２１６７６３逆转ＰＤ细胞模型细胞核内ＳＩＲＴ２活性升高逡逑Ｆｉｇ．７邋ＳＢ２１６７６３邋ｒｅｖｅｒｓｅ邋ｔｈｅ邋ｉｎｃｒｅａｓｅｄ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ｏｆ邋ＳＩＲＴ２邋ａｆｔｅｒ邋６－ＯＨＤＡ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ邋ｉｎ邋ＳＨ－ＳＹ５Ｙ逡逑ｃｅｌｌｓ邋ｎｕｃｌｅａｒ．Ｔｈｅ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ｏｆ邋ＳＩＲＴ２邋ｗａｓ邋ｉｎｃｒｅａｓｅｄ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃｅｎｔｌｙ邋ａｎｄ邋ＳＢ２１６７６３邋ｒｅｖｅｒｓｅｄ邋ｔｈｅ邋ｃｈａｎｇｅ逡逑ａｆｔｅｒ邋６－ＯＨＤＡ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ邋ｉｎ邋ＳＨ－ＳＹ５Ｙ邋ｃｅｌｌｓ．Ａｌｌ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ邋ｗｅｒｅ邋ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ邋ｉｎ邋ｔｈｒｅｅ邋ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎｓ．逡逑Ｔｈｅ邋ｄａｔａ邋ｗｅｒｅ邋ｓｈｏｗｎ邋ａｓ邋ｔｈｅ邋ｍｅａｎ土ＳＤ．邋★／？＜０．０５，邋＊★／？＜０．０】．逡逑八、ＧＳＫ－３Ｐ在体外可磷酸化ＳＩＲＴ２逡逑通过前面ＳＩＲＴ２活性检测结果显示ＰＤ细胞模型内ＳＩＲＴ２活性增高，而逡逑ＧＳＫ－３Ｐ抑制剂ＳＢ２１６７６３能逆转ＳＩＲＴ２活性的升高。所以我们想知道ＧＳＫ－３Ｐ是逡逑如何调节ＳＩＲＴ２活性的呢？也即是通过哪种修饰方式来调节ＳＩＲＴ２活性的呢？逡逑通过ＧＰＳ３．０软件预测发现ＧＳＫ－３｜３可磷酸化ＳＩＲＴ２。是否ＧＳＫ－邛是通过磷逡逑酸化ＳＩＲＴ２来调节ＳＩＲＴ２活性？所以我们想通过体外磷酸化反应后行放射自显逡逑影检测，明确ＧＳＫ－３Ｐ是否能磷酸化ＳＩＲＴ２，最后通过质谱来鉴定ＧＳＫ－３Ｐ磷酸化逡逑ＳＩＲＴ２的具体氨基酸残基位点。为了进行体外磷酸化反应，我们需要得到纯化的逡逑ＳＩＲＴ２蛋白
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R742.5

【相似文献】