ATP-P2X4受体信号轴调控凋亡因子在帕金森病发病机制中的作用

发布时间：2020-06-08 03:44

【摘要】：目的:探讨在6-OHDA诱导的帕金森大鼠模型中P2X4受体及凋亡蛋白caspase-3的表达情况,调控ATP-P2X4受体信号轴对凋亡蛋白caspase-3相对表达量的影响。方法:本实验选取雄性Wistar大鼠为实验对象,将大鼠随机分成8组,每组20只。将大鼠麻醉,准确定位左侧黑质后,按照以下方式处理各组实验动物:空白对照组、6-OHDA组大鼠黑质注射含0.3%抗坏血酸的生理盐水,携带空载si-RNA慢病毒阴性对照组、携带空载si-RNA慢病毒6-OHDA组黑质内注射携带空载si-RNA慢病毒,携带过表达si-RNA慢病毒阴性对照组、携带过表达si-RNA慢病毒6-OHDA组黑质内注射携带过表达si-RNA慢病毒,携带抑制性si-RNA慢病毒阴性对照组、携带抑制性si-RNA慢病毒6-OHDA组注射携带抑制性si-RNA慢病毒。在适应实验环境1周后,构建大鼠PD模型,在上述空白及阴性对照组动物脑内含0.3%抗坏血酸的生理盐水,在上述各6-OHDA组大鼠黑质中注射6-OHDA溶液。造模后饲养1周进行阿扑吗啡诱发实验,筛选旋转实验阳性的成功PD动物模型。将大鼠处死后,对其脑组织进行冰冻切片及免疫荧光染色,计数TH阳性多巴胺能神经细胞数量。分离提取大鼠黑质总RNA及总蛋白,利用荧光实时定量PCR及蛋白印迹法检测各组大鼠中P2X4受体及凋亡蛋白caspase-3的mRNA及蛋白相对表达量。结果:1、利用免疫荧光法检测TH阳性的多巴能神经细胞数量:与空白对照组相比,6-OHDA组TH阳性多巴胺能神经细胞数量明显减少(P0.01),携带空载si-RNA慢病毒阴性对照组细胞数无明显差异。在与携带空载si-RNA慢病毒阴性对照组对比中,携带过表达si-RNA慢病毒6-OHDA组细胞数明显减少,携带抑制性si-RNA慢病毒6-OHDA组则有所增加,两者均具有统计学意义(P0.01)。2、PCR法检测caspase-3 mRNA的相对表达量:与空白对照组大鼠黑质中caspase-3 mRNA的表达相比较,6-OHDA组明显升高(P0.01)。携带过表达si-RNA慢病毒6-OHDA组较携带空载si-RNA慢病毒6-OHDA组大鼠黑质caspase-3 mRNA的表达升高,具有统计学意义(P0.05);而携带抑制性si-RNA慢病毒6-OHDA组表达较携带空载si-RNA慢病毒6-OHDA组降低(P0.05)。3、western blot检测大鼠黑质中caspase-3蛋白的相对表达量:与空白对照组相比,6-OHDA组蛋白表达增加(P0.01)。对比携带空载si-RNA慢病毒6-OHDA组,携带过表达si-RNA慢病毒6-OHDA组caspase-3蛋白表达明显增高,差异具有统计学意义(P0.01);而携带抑制性si-RNA慢病毒6-OHDA组大鼠黑质中的蛋白较携带空载si-RNA慢病毒6-OHDA组明显降低,差异具有统计学意义(P0.01)。结论:当P2X4受体基因过表达时,caspase-3 mRNA和蛋白的表达均增高,引起黑质内功能细胞丢失增多。当抑制P2X4受体基因表达时,caspase-3基因及蛋白的表达均较携带空载病毒的PD大鼠下降,相应地减少了黑质内多巴胺能神经元的丢失。ATP-P2X4受体信号轴能够在帕金森病模型中,可通过调控caspase-3的表达参与其发病过程。
【图文】：

图 1 慢病毒在黑质 TH 阳性多巴胺能细胞中的表达情况（400 倍）注：a 图为酪氨酸羟化酶在黑质中表达的情况；b 图为慢病毒在黑质中表达的情况；c 图是a 图和 b 图的融合图像，显示慢病毒在黑质 TH 阳性多巴胺能细胞中的表达情况用荧光显微镜观察各组大鼠黑质切片标本，，计数各切片中 TH 阳性多巴胺能神经细胞的数量并比较（图 2）。通过分析比较可得，与空白对照组（7336 ± 83.16）相比，6-OHDA 组 TH 阳性多巴胺能神经细胞数量（4303 ± 106.3）明显减少（P<0.01）；携带空载 si-RNA 慢病毒阴性对照组细胞数（7212 ± 217.8）无明显差异。在与携带空载 si-RNA 慢病毒阴性 6-OHDA 组对比中，携带过表达 si-RNA 慢病毒 6-OHDA组细胞数（3393 ± 95.44）明显减少，携带抑制性 si-RNA 慢病毒 6-OHDA 组（4929 ±123.7）则有所增加，两者均具有统计学意义（P<0.01）。如图 2、图 3、表 1 所示。

13图 2 各组大鼠黑质中 TH 阳性多巴胺能神经元（免疫荧光染色，100 倍）为空白对照组，b 为 6-OHDA 组，c 为携带空载 si-RNA 慢病毒阴性对照组A 慢病毒 6-OHDA 组，e 为携带过表达 si-RNA 慢病毒阴性对照组，f 为携带毒 6-OHDA 组，g 为携带抑制性 si-RNA 慢病毒阴性对照组，h 为携带抑制性慢病毒 6-OHDA 组表 1 各组大鼠黑质中 TH 阳性细胞数量（X± S）（个）TH 阳性多巴胺能神经细胞数量 P 值
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R742.5

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 杨琪;赵星皓;卓少元;;Caspase-1与肿瘤相关性研究进展[J];中华中医药学刊;2019年01期

2 夏忆;卢建远;何向东;陈莹;字向东;;牦牛Caspase-3克隆、序列分析与组织表达研究[J];西南民族大学学报(自然科学版);2019年05期

3 张诗田;张达;牛文彦;;肥胖患者炎性单核细胞Caspase活性的研究[J];天津医科大学学报;2017年02期

4 李学玲;董红芬;;血清IL-18、Caspase-3水平与新生儿缺氧缺血性脑病的相关性[J];实用临床医药杂志;2016年03期

5 张潇月;孔庆宏;王冠林;张宽仁;;Procaspase-8/Caspase-8非凋亡作用的研究进展[J];生命的化学;2016年05期

6 黄巧丽;周华;李涛;;Caspase的非凋亡性作用[J];生命的化学;2015年03期

7 Fatih 噻elik;Fatih Ulas;Zeynep Günes 銉zünal;Tülin F|rat;Serdal 噻elebi;

本文编号：2702488