microRNA-181c调节Th17细胞分化和实验性自身免疫性脑脊髓炎的作用机制研究

发布时间：2020-06-09 05:52

【摘要】：研究目的:实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalo-myelitis,EAE)以中枢神经系统炎症脱髓鞘、神经传导受损和瘫痪为特征,是一种典型的自身免疫性神经退行性疾病,是多发性硬化症(Multiple sclerosis,MS)的成熟动物模型。尽管多发性硬化症的确切发病机制尚未完全清楚,但多项研究证实,外周初始CD4~+T细胞分化为辅助性T细胞(Th细胞)亚群的过程失调,以及中枢神经系统(CNS)中分泌IL-17细胞因子的Th17细胞浸润增多,与疾病的发生发展密切相关。miR-181家族是一类重要的Th细胞亚群调控因子,但作为其家族成员之一,miR-181c在是否可通过调节Th17细胞分化进而影响实验性自身免疫性脑脊髓炎病理发生方面的研究尚属空白。因此,本研究拟探究miR-181c在Th17细胞分化和实验性自身免疫性脑脊髓炎的发生发展中所发挥的作用与机制。方法:通过检测EAE小鼠在发病不同阶段的体内miR-181c的表达量变化,确定miR-181c与疾病发生发展的关联。利用重组慢病毒(Lentivirus),构建敲低miR-181c表达的小鼠,通过RT-PCR和GFP免疫荧光染色验证敲低和感染效率。分组诱导EAE小鼠模型,比较敲低miR-181c表达后对疾病发生发展的影响,并通过脊髓切片的H.E.和Fast blue染色,评估CNS中炎性细胞浸润以及脱髓鞘的程度。分离小鼠发病初期以及高峰期时的外周淋巴细胞和中枢内单个核细胞,流式检测与EAE发病高度相关的辅助性T细胞亚群(Th1细胞、Th17细胞、Treg细胞)的比例变化。通过原代细胞体外定向分化实验,检测miR-181c在不同Th细胞亚群中的表达,并通过流式和RT-PCR检测敲低miR-181c表达后对Th细胞分化的影响。通过生物信息学方法,预测miR-181c可能影响的信号通路并进一步预测靶基因,通过Western blot和荧光素酶报告基因等实验做进一步功能性验证。此外,通过对Gene Expression Omnibus数据库中的已发表的研究多发性硬化症患者和健康对照受试者miRNA表达谱的项目进行生物信息学分析,探究多发性硬化症患者中miR-181c水平变化。结果:在本研究中,我们发现敲低miR-181c表达的小鼠可延迟实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)发病并降低了其临床评分,分离EAE小鼠外周及中枢内淋巴细胞经分析后发现,其体内的辅助性T细胞亚群中,Th17细胞比例呈现明显减少。经进一步体外实验研究后,我们发现miR-181c在Th17细胞中呈特异性高表达,并且TGF-β信号通路的负性调节因子Smad7是miR-181c的潜在靶基因。高表达miR-181c及荧光素酶报告研究显示miR-181c可直接抑制Smad7表达。敲低miR-181c后Smad7表达显著上调,同时可阻碍T细胞中TGF-β诱导的Smad2/3激活,增强Th17细胞分化负性调节因子IL-2的表达,进而抑制Th17细胞的分化。此外,通过对Gene Expression Omnibus数据库中的已发表的研究多发性硬化症(MS)患者和健康对照受试者miRNA表达谱的项目进行了分析,我们发现与健康对照组相比,多发性硬化症(MS)患者的外周血中miR-181c水平相对升高,而Smad7的表达水平相对降低。结论:敲低miR-181c表达可降低实验性自身免疫性脑脊髓炎的发病程度,抑制中枢神经系统内炎症性细胞浸润和脱髓鞘。miR-181c在Th17细胞中呈特异性高表达;miR-181c可靶向抑制Smad7基因表达,解除Smad7对TGF-β介导的Smad信号通路的抑制作用,进而增强Smad信号通路激活对IL-2自分泌的抑制作用,最终促进Th17细胞的分化。此外,通过对Gene Expression Omnibus数据库中的已发表的研究多发性硬化症患者和健康对照受试者miRNA表达谱的项目进行了分析,与健康对照组相比,多发性硬化症患者的外周血中miR-181c水平相对升高。我们的研究结果确定了一种新的与Th17细胞分化和自身免疫密切相关的miRNA,miR-181c可能成为多发性硬化症患者治疗的潜在靶点。我们的研究为进一步探究多发性硬化症的发病机制提供了线索,并可能为以后多发性硬化症患者的诊断和治疗提供新选择。
【图文】：

表达水平,小鼠,发生发展,腹股沟淋巴结

论文一、体内研究：microRNA-1c 在 EAE 小鼠发病初期和高峰期表达升CD4+T 细胞在 EAE 发生发展过程中起改变与 EAE 的发生发展是否存在关联病初期、EAE 发病高峰期、EAE 缓解淋巴结（腹股沟淋巴结、腋窝淋巴结行检测。我们发现，与 WT 组相比，在 EAE 发病初期和发病高峰期呈明显iR-181c 表达水平与 WT 组大致相当（

慢病毒,小鼠,组织包埋,特异性

天津医科大学博士学位论文一、体内研究：microRNA-181c 对实验性自身免疫性脑脊髓炎发病的影响研磨器官组织细胞提取 RNA 检测，转染重组慢病毒后，肝脏、淋巴结、脾脏中miR-181c 表达呈显著降低（图 2 A，B）。由于已有研究表明同家族的 miR-181a和 miR-181b 可影响 EAE 的发病，因此我们同时对慢病毒敲低 miRNA 的特异性也进行了验证，在转染了 LV-sh-miR-181c 慢病毒的淋巴结和脾脏细胞中，miR-181a 和 miR-181b 的表达水平与对照组相比没有明显改变（图 2 C）。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R744.51

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