胶质瘤干细胞、肿瘤相关巨噬细胞和负性共刺激分子PD-L1在脑胶质瘤组织中的表达及其意义

发布时间：2020-06-09 07:13

【摘要】：背景:脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤,呈浸润性生长,手术难以完全切除,临床病情进展快,预后差,具有高侵袭性和破坏力、复发率高、放化疗抵抗等特点。高级别脑胶质瘤尤其是多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM)的致死率极高,5年存活率不超过5%。对脑胶质瘤的治疗目前遇到的一个重要挑战是胶质瘤细胞具有诱导产生局部和系统性免疫抑制的能力,从而限制了固有免疫对肿瘤的防御和适应性免疫治疗的疗效。脑胶质瘤具有多种方式逃避机体的免疫监控,这一免疫逃逸过程受肿瘤细胞和肿瘤微环境(Tumor Microenvironment,TME)的共同影响。研究表明,作为“种子”的胶质瘤干细胞(Glioma Stem Cells,GSCs)和作为“土壤”的肿瘤微环境在脑胶质瘤的免疫逃逸中起着十分重要的作用。目前对与免疫逃逸有关的细胞表面分子研究较多的是共刺激分子B7家族,其中负性共刺激分子PD-L1是目前研究的热点之一。在脑胶质瘤组织中,GSCs、肿瘤微环境中的主要细胞—肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated Macrophages,TAMs)和负性共刺激分子PD-L1是同时存在的,以往的报道多仅研究负性共刺激分子PD-L1在两种细胞中各自的表达情况,同时研究三者在脑胶质瘤免疫逃逸机制中的作用,国内外鲜见报道。目的:本研究将在蛋白和mRNA水平探讨不同病理级别脑胶质瘤组织中GSCs、TAMs和负性共刺激分子PD-L1的表达情况及其之间的相关性,并以负性共刺激分子PD-L1为桥梁探索GSCs和TAMs在脑胶质瘤免疫逃逸行为中的关系以及可能的治疗靶点。方法:以CD133作为胶质瘤干细胞的标志物,以CD68作为肿瘤相关巨噬细胞的标志物。采用免疫荧光双染法检测不同病理级别脑胶质瘤组织中CD68和PD-L1蛋白的共表达情况;采用免疫组化SP法在蛋白水平检测不同病理级别脑胶质瘤组织中CD133、CD68和PD-L1蛋白的表达情况及其之间的相关性;采用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time fluorescent PCR,qRT-PCR)技术从mRNA水平检测不同病理级别脑胶质瘤组织中CD133、CD68和PD-L1基因的表达情况及其之间的相关性。结果:1.免疫荧光双染法实验结果显示:所有脑胶质瘤组织中均有CD68和PD-L1蛋白的表达,主要位于细胞膜及细胞浆;双重荧光染色结果显示大部分PD-L1分子表达于TAMs上,即大部分PD-L1阳性细胞为肿瘤相关巨噬细胞;随着脑胶质瘤病理级别的升高,CD68和PD-L1蛋白的共表达增加。2.免疫组化实验结果显示:所有脑胶质瘤组织中均有CD133、CD68和PD-L1蛋白的表达,主要表达于细胞浆中,少量表达于细胞膜上,多呈黄色或者棕黄色颗粒;随着脑胶质瘤病理级别的升高,CD133、CD68和PD-L1蛋白的表达量逐渐增加,Spearman秩相关分析显示在脑胶质瘤组织中,CD133、CD68和PD-L1蛋白的表达水平与病理级别呈正相关(r=0.831,P0.001;r=0.795,P0.001;r=0.711,P0.001);CD133、CD68和PD-L1蛋白在高级别组脑胶质瘤组织中的表达水平明显高于低级别组脑胶质瘤组织(t=13.854,P0.001;t=12.838,P0.001;t=6.794,P0.001);Spearman秩相关分析显示脑胶质瘤组织中CD133蛋白与CD68蛋白的表达呈正相关(r=0.881,P0.001),并且低级别组中CD133与CD68蛋白呈正相关(r=0.425,P=0.024),高级别组中CD133与CD68蛋白也呈正相关(r=0.620,P0.001);CD133蛋白与PD-L1蛋白的表达呈正相关(r=0.753,P0.001),并且低级别组中CD133与PD-L1蛋白呈正相关(r=0.432,P=0.022),高级别组中CD133与PD-L1蛋白也呈正相关(r=0.407,P=0.031)。3.实时荧光定量PCR结果显示:随着脑胶质瘤病理级别的升高,CD133、CD68和PD-L1基因mRNA的表达量逐渐增加,Spearman秩相关分析显示在脑胶质瘤组织中,CD133、CD68和PD-L1基因mRNA的表达水平与病理级别呈正相关(r=0.647,P0.001;r=0.499,P0.001;r=0.445,P=0.001);两样本比较的秩和检验结果显示CD133、CD68和PD-L1基因mRNA在高级别组脑胶质瘤组织中的表达水平明显高于低级别组脑胶质瘤组织(z=6.424,P0.001;z=3.556,P0.001;z=2.999,P=0.003);Spearman秩相关分析显示脑胶质瘤组织中CD133基因mRNA与CD68基因mRNA的表达呈正相关(r=0.525,P0.001),并且低级别组中CD133与CD68基因mRNA呈正相关(r=0.518,P=0.005),高级别组中CD133与CD68基因mRNA也呈正相关(r=0.500,P=0.007);CD133基因mRNA与PD-L1基因mRNA的表达呈正相关(r=0.431,P0.001),并且低级别组中CD133与PD-L1基因mRNA呈正相关(r=0.398,P=0.036),高级别组中CD133与PD-L1基因mRNA也呈正相关(r=0.417,P=0.027)。结论:1.脑胶质瘤组织中负性共刺激分子PD-L1主要由肿瘤微环境中的肿瘤相关巨噬细胞表达。2.CD133、CD68和PD-L1的表达与脑胶质瘤的恶性程度密切相关;GSCs与表达负性共刺激分子PD-L1的TAMs呈正相关。
【图文】：

胶质瘤干细胞、肿瘤相关巨噬细胞和负性共刺激分子 PD-L1 在脑胶质瘤组织中的表达及其意义 2018 届硕士学位论文二、结果1. CD68 和 PD-L1 蛋白在脑胶质瘤组织中的共表达情况免疫荧光双染法实验结果显示：所有脑胶质瘤组织中均有CD68和PD-L1蛋白的表达，，主要位于细胞膜及细胞浆；CD68 阳性细胞呈现绿色荧光，PD-L1阳性细胞呈现红色荧光，双重阳性细胞呈现黄色荧光，双重荧光染色结果显示大部分 PD-L1 分子表达于 TAMs 上，即大部分 PD-L1 阳性细胞为肿瘤相关巨噬细胞；随着脑胶质瘤病理级别的升高，CD68 和 PD-L1 蛋白的共表达增加（见图 1、2）。

图 2 CD68 与 PD-L1 蛋白在高级别脑胶质瘤组织中的共表达（免疫荧光双染，×400）A：CD68 阳性细胞呈现绿色荧光；B：PD-L1 阳性细胞呈现红色荧光；C：CD68 与 PD-L1 免疫荧光双染叠加图像，双重阳性细胞呈现黄色荧光，共表达较多Fig.2 Co-expression of CD68 and PD-L1 protein in high-grade glioma tissues (Doubleimmunofluorescence staining, ×400)A: CD68 positive cells showed green fluorescence; B: PD-L1 positive cells showed red fluorescence; C:Double positive cells of CD68 and PD-L1 showed yellow fluorescence, more co-expression
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.41

【参考文献】

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本文编号：2704342