左旋龙脑与双氢青蒿素对胶质瘤化疗的增敏作用研究

发布时间：2020-06-09 12:51

【摘要】：第一部份左旋龙脑暂时性开放血脑屏障增强顺铂治疗小鼠颅内胶质瘤效果的研究研究背景：胶质瘤是成年人中最常见的颅内严重恶性肿瘤。其组织学特征为肿瘤细胞侵袭浸润入肿瘤周围正常脑组织中。目前标准的胶质瘤治疗方法为尽可能地安全地手术切除胶质瘤组织,然后行放化疗治疗。但是,即使胶质瘤患者接受了良好的手术治疗以及行放化疗后,间变性星形细胞瘤患者的中位生存期也只是接近22个月,而胶质母细胞瘤患者的中位生存期则仅为16个月。目前,针对胶质瘤仍然缺乏有效系统的治疗方法。顺铂作为一种铂类化疗药物现在已经在临床中应用于多种恶性肿瘤的治疗。研究证明顺铂能够抑制修复酶06-alkylguanine-DNA烷基转移酶的活性,从而广泛应用于骨肉瘤、移行细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤、间皮瘤、转移瘤和生殖细胞肿瘤的治疗。但是,由于大脑中血脑屏障的存在,顺铂很难透过血脑屏障,以致只有很少的顺铂可以进入大脑中的肿瘤组织,从而顺铂对颅内胶质瘤的治疗效果受到了很大的限制。血脑屏障(Blood-brain barrier, BBB)是由内皮细胞(endothelial cell)、星形胶质细胞(astrocyte)、小胶质细胞(microglia)、周细胞(pericyte)和基膜(basal lamina)等组成的复杂网络屏障系统。血脑屏障在颅内起到了限制外源性分子进入中枢神经系统的作用。但是,血脑屏障的这一特征,在保护大脑的同时,也限制了化疗药物通过血液进入脑组织。研究表明血脑屏障的存在限制了98%的小分子和100%的大分子水溶性药物进入脑组织。虽然许多科研工作者经过不断的努力试图找到更好的策略和方法促进抗癌药物透过血脑屏障,例如对血脑屏障造成暂时性的损伤,或者化学修饰化疗药物使其能够利用大脑内源性转运系统进入脑组织,提高抗癌药物透过血脑屏障的能力,但是到目前为止许多实验结果都不是很令人满意。冰片是脂溶性双环单萜类莰烷衍生物,由缬草,洋甘菊,薰衣草等植物中提取而得。冰片的使用有着悠久的历史,在中国传统医学中就将其作为信使药物使用。一般来说冰片分为合成冰片和自然冰片两种。合成冰片一般含有右旋龙脑、左旋龙脑以及异龙脑等。而自然冰片则含有左旋龙脑。有研究显示异龙脑比左旋龙脑存在更高的粘膜刺激性和肝毒性。另外自然冰片已经记录于中华人民共和国药典(2005和2010版)中,并且在中国传统医学中与合成冰片相比更推荐使用自然冰片。美国食品及药物管理局已经批准自然冰片应用于食物中,自然冰片已经被认为是一种安全的化合物。前期研究证明冰片可以促进血脑屏障的开放并且增加纳米颗粒进入脑组织还具有脑保护作用。但是,冰片单体左旋龙脑是否能够促进顺铂透过血脑屏障目前还不清楚。同样目前还没有文献报道左旋龙脑能否提高顺铂对胶质瘤的治疗效果,延长荷瘤动物的生存时间。由于顺铂对胶质瘤有治疗作用,冰片能够促进血脑屏障开放,从而联合顺铂和冰片治疗颅内肿瘤应该是可行的。因此,在本项目中我们研究冰片单体左旋龙脑是否具有提高顺铂透过血脑屏障的能力,从而能够协助顺铂治疗荷瘤小鼠,最后证明左旋龙脑可以提高顺铂对胶质瘤的治疗效果。研究目的：1.观察左旋龙脑对血脑屏障通透性的影响及其时-效、量-效关系。2.观察左旋龙脑对实验小鼠脑含水量及动物行为学的影响,探讨其安全性。3.观察左旋龙脑对顺铂透过血脑屏障的影响。4.研究顺铂联合左旋龙脑对胶质瘤的治疗效果。材料和方法1.左旋龙脑对血脑屏障开放作用的研究：对实验小鼠脑组织中的依文思蓝进行荧光分析和定量检测,研究左旋龙脑对血脑屏障开放的作用。2.7.0T MR研究左旋龙脑对血脑屏障开放的作用：采用7.0T MR检测使用左旋龙脑处理实验小鼠后,实验小鼠脑组织的磁共振信号变化情况。3.探讨左旋龙脑是否会导致实验小鼠脑水肿：左旋龙脑处理实验小鼠4h后处死,采用干-湿法检测实验动物脑组织含水量。4.探讨左旋龙脑是否存在潜在的毒性作用：采用翻正反射评价实验小鼠服用左旋龙脑后,左旋龙脑是否会对实验小鼠造成潜在的毒性作用。5.探索左旋龙脑是否能够促进顺铂透过血脑屏障：采用原子吸收光谱仪检测使用左旋龙脑后实验小鼠脑组织中的铂含量。6.探讨左旋龙脑对顺铂治疗胶质瘤效果的促进作用：采用荷瘤实验动物的生存期评价左旋龙脑对顺铂治疗胶质瘤效果的作用。研究结果：1.左旋龙脑对血脑屏障开放的时-效关系。实验小鼠服用左旋龙脑(1,200 mg/kg) 10 min后,脑组织中的依文思蓝含量为15.77±0.61 μg/g,20 min后,脑组织中的依文思蓝含量为18.55±0.95 μg/g,达到最高峰,30 min后,脑组织中的依文思蓝含量开始下降为16.64±1.15μg/g,随着时间的延长,40,50,60 min组实验小鼠脑组织中的依文思蓝含量明显下降,分别为8.25±0.57,7.718±1.82和7.302±0.94 μg/g。2.左旋龙脑对血脑屏障开放的量-效关系。实验小鼠服用左旋龙脑300,600,900,1200 mg/kg后20 min,脑组织中的依文思蓝含量分别为13.42±1.07,12.39±1.05,15.25±0.82和18.55±0.95μg/g,与空白组相比血脑屏障的通透性明显增高(P0.05)。应用7.0T MR证实服用左旋龙脑后血脑屏障对Gd-DTPA的通透性升高。3.左旋龙脑对脑水肿没有明显影响。正常小鼠脑含水量为78.02±0.18%。当实验小鼠服用300,600和1,200 mg/kg左旋龙脑后4 h,检测实验动物脑含水量发现使用左旋龙脑的实验小鼠与正常组相比脑含水量没有明显差异。4.低剂量的左旋龙脑对实验动物的动物行为学没有明显影响。使用左旋龙脑的剂量为900和1,200 mg/kg对实验动物的翻正反射有明显影响,300,600 mg/kg左旋龙脑剂量对实验小鼠翻正反射没有明显影响。5.左旋龙脑可以促进顺铂进入肿瘤组织和瘤旁组织。口服300 mg/kg左旋龙脑可以增加瘤旁组织中顺铂含量0.37±0.12μg/g,肿瘤组织中顺铂的含量增加0.44±0.13μg/g。6.左旋龙脑联合顺铂治疗荷瘤实验小鼠可以提高胶质瘤荷瘤小鼠的生存期。顺铂联合左旋龙脑治疗小鼠的中位生存时间比单独使用顺铂治疗的小鼠中位生存时间长(24±4.9 v.s.19.3±3.9 d,P0.05)。研究结论：1.左旋龙脑可暂时性开放实验小鼠血脑屏障。给药后10 min血脑屏障通透性增高,20 min后达到最高峰,30 min后逐渐恢复正常。血脑屏障的开放程度对左旋龙脑具有剂量依赖性。2.治疗剂量的左旋龙脑不诱发实验动物脑水肿,对动物行为学无影响。3.左旋龙脑可以促进顺铂透过血脑屏障进入小鼠脑组织和胶质瘤组织,提高顺铂治疗荷瘤小鼠的生存期。第二部份双氢青蒿素的化疗增敏作用及诱导胶质瘤干细胞凋亡作用机制研究研究背景：胶质瘤是成年人最常见的原发性恶性脑肿瘤。虽然与其他癌症相比脑肿瘤的发病率相对较低,但是接受正规治疗的胶质瘤患者的中位数生存期也仅为15个月,而且大多数脑肿瘤在接受初次治疗后9个月内复发。恶性胶质瘤的主要组织学特性为肿瘤细胞像树根一样向周围正常脑组织侵袭。迄今为止,手术治疗仍然是胶质瘤治疗最主要的手段,但即使胶质瘤患者在接受标准手术治疗后,连续接受标准的放化疗,其预后仍然很差。因此,许多方法被尝试用来治疗胶质瘤,但因为胶质瘤的凋亡抵抗能力的存在,阻碍了胶质瘤治疗的进展。现在人们正在努力研究新的化合物,希望能够更有效地杀死具有抗放化疗能力的肿瘤细胞。最近有研究报道在肿瘤中存在一群称为“肿瘤干细胞”的细胞。它们可以调控肿瘤的形成和生长。胶质瘤干细胞(Glioma stem cell, GSCs)已被证明在胶质瘤的生长,侵袭,血管生成和免疫逃避中发挥了关键作用。他们也被确认为是化疗-和放疗-抵抗的根源。即使多数肿瘤细胞被消除后,GSCs也能生存下来并重新创建出新的肿瘤。因此,如果专门针对GSCs进行治疗,有望在胶质瘤特别是恶性胶质母细胞瘤的治疗中取得更好的疗效。因为胶质瘤干细胞具有对化疗药物的抵抗能力,抑制胶质瘤干细胞的增长显得非常困难。最近,一些天然产物被报道具有杀死肿瘤干细胞的作用。双氢青蒿素(Dihydroartemisinin, DHA)是中草药青蒿中的有效活性成分。并且是目前FDA批准和世卫组织建议的安全、有效的主要抗疟药物。最近的研究表明,双氢青蒿素也对肺癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌等一些人类恶性肿瘤具有细胞毒性。此外,GSCs对胶质瘤的复发及转移具有促进作用,也代表着胶质瘤患者的高死亡率。因此,GSCs被认为是发展未来癌症治疗方法的一个重要目标或者针对胶质瘤干细胞的治疗可以改善胶质瘤患者的预后。此外丝氨酸／苏氨酸激酶Akt在肿瘤发生中起着重要的作用。Akt的活性在胶质瘤干细胞中的生物学意义在最近已经确立。超表达p-Akt可以抑制细胞凋亡。也就是说,Akt激活能预示胶质瘤的预后不良。Akt的磷酸化可以改变Caspase-3、Bcl-2、NF-κB和其他具有诱导或抑制细胞凋亡作用的蛋白质转录因子的活性。基于p-Akt对胶质瘤干细胞具有重要作用的研究结果,以及双氢青蒿素的抗胶质瘤作用,我们推测双氢青蒿素可能通过抑制p-Akt在GSC中的表达诱导胶质瘤干细胞凋亡。在本研究项目中,我们通过观察双氢青蒿素对尼莫司汀(ACNU)的增敏作用,研究双氢青蒿素对GSCs的影响,专注于凋亡,检测参与这个过程的p-Akt和Caspase-3的表达情况,阐明在双氢青蒿素对GSCs产生生物学作用可能的分子机制。研究目的：1.观察双氢青蒿素处理后胶质瘤干细胞的形态学改变。2.观察双氢青蒿素对胶质瘤干细胞增殖能力和克隆成形能力的影响。3.观察双氢青蒿素对胶质瘤干细胞细胞周期抑制及诱导细胞凋亡的作用。4.研究双氢青蒿素对胶质瘤干细胞作用的潜在分子机制。材料和方法：1.通过免疫荧光的方法对胶质瘤干细胞的干细胞标记物CD133, SOX2和Nestin进行检测。2.采用倒置显微镜对双氢青蒿素处理后的胶质瘤干细胞进行形态学观察。3.采用CCK-8实验检测双氢青蒿素对胶质瘤干细胞增殖能力的影响。4.应用细胞周期技术和Annexin-V/PI细胞凋亡流式检测技术研究双氢青蒿素对胶质瘤干细胞细胞周期和凋亡的作用。5.为了进一步阐述双氢青蒿素对胶质瘤干细胞作用的分子机制,采用Western blotting实验检测p-Akt和Cleaved Caspase-3的表达水平。研究结果：1.双氢青蒿素对ACNU治疗胶质瘤有增敏作用。2.双氢青蒿素抑制胶质瘤干细胞的细胞活性。双氢青蒿素处理后的胶质瘤干细胞有明显的形态学改变且具有量-效关系。双氢青蒿素同时抑制GL261胶质瘤干细胞和普通胶质瘤细胞的细胞活性,而且双氢青蒿素对胶质瘤干细胞的活性抑制强度比普通胶质瘤细胞要高,双氢青蒿素还抑制胶质瘤干细胞的克隆形成能力。3.双氢青蒿素可以抑制胶质瘤干细胞的生长。当使用80 gM双氢青蒿素处理胶质瘤干细胞24 h后65.7±2.09%的细胞处于G0/G1,明显高于空白对照组(51.4±2.59%,P0.05)。80μM双氢青蒿素处理胶质瘤干细胞24 h后,凋亡细胞的数量为69.26±3.29%,明显高于对照组(7.9±1.36%,P0.05).4.双氢青蒿素处理GL261胶质瘤干细胞后,p-Akt的表达量随着双氢青蒿素浓度的增高而减少,同时Cleaved Caspase-3的表达增高。研究结论：1.双氢青蒿素对ACNU治疗体外培养GL261胶质瘤有增敏作用。2.双氢青蒿素可影响GL261胶质瘤干细胞的形态,抑制其生长和克隆形成能力,阻滞其细胞周期,诱导其凋亡。对GL261胶质瘤干细胞的抑制作用比普通胶质瘤细胞强。3.双氢青蒿素可抑制GL261胶质瘤干细胞中Akt的活化,增加Cleaved Caspase-3的表达。
【图文】：

标准曲线,左旋龙脑,实验小鼠,脑组织

２．４N１巧光显微镜观察逡逑经左旋龙脑处理后，各时相点可见实验小鼠脑组织中有少量的均匀的红色巧光染色逡逑颗粒，尤其２０邋ｍｉｎ组实验小鼠脑组织中红色巧光颗粒染色最为明显（见图２．３）；而１０逡逑ｍｉｎ组和３０邋ｍｉｎ组实验小鼠脑组织中红色焚光颗粒染色比２０邋ｍｉｎ组要暗淡一些。同时，逡逑４０，邋５０，邋６０邋ｍｉｎ组实验小鼠脑组织中红色巧光颗粒染色表现出随时间延长变的越来越暗逡逑淡的特点。逡逑■■国逡逑图２．邋３巧光显微镜下观察左旋龙脑促进ＥＢ透过血脑屏除的时－效关系逡逑２．４１．２定量分析逡逑不同浓度依文思蓝巧巧的光密度值（见表２．邋１）Ｗ及ＥＢ标准曲线（见图２．邋４）。逡逑方程为邋ｙ＝０．０８７９９ｘ＋０．０２０３８逡逑民邋２＝邋０．Ｗ９５逡逑ｙ为溶液中ＥＢ的光密度值，Ｘ为溶液中ＥＢ的浓度山ｇ／ｍｌ）逡逑表２．１不问密度依文思蓝（Ｅ巧光密度值逡逑浓度逦８邋ｌｉｇ／ｍｌ逦４邋Ｍ－ｇ／ｍｌ逦２邋［ｉｇ／ｍｌ逦１邋ｆｉｇ／ｍｌ逦０．５邋峭／ｍｌ邋０．２５邋［ｉｇ／ｍｌ逡逑ＯＤ邋值逦０．７３９逦０．３６３逦０．１４５逦０．１２４逦０．０７８逦０．０６０逡逑３５逡逑

左旋龙脑,血脑屏障,时间组,时效关系

经不同浓度左旋龙脑处理后２０邋ｍｉｎ，可见３００，邋６００，邋９００，口００邋ｍｇ／ｋｇ实验小鼠脑组逡逑织中均有不同巧光强度的红色巧光染色颗粒，尤其１２００邋ｍｇ／ｋｇ组实验小鼠脑组织中红色巧逡逑光颗粒染色最为明显（见图２．邋６）；而对照组实验小鼠（空白组和液体石蜡组实验小鼠）脑组织逡逑中几乎不可见红色巧光染色颗粒。同时，从依文思蓝（Ｅ巧示踪脑姐织切片还可观察到，３００，逡逑６００，邋９００邋ｍｇ／ｋｇ组实验小鼠脑组织中红色巧光颗粒染色强度无明显差异，而且随着左旋龙逡逑脑浓度的增加，，不同浓度实验组小鼠脑子ＥＢ含量增加（见图２．巧。逡逑３７逡逑
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.41

【参考文献】