MiR-181a-5p调控胶质瘤细胞替莫唑胺耐药性和侵袭力的研究

发布时间：2020-06-10 03:04

【摘要】：目的:神经胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)以其高发病率(占恶性脑肿瘤的60%)、高复发率(100%)和高死亡率已成为临床亟待解决的难题。近期,肿瘤治疗相关指南指出:经病理确诊的临床胶质瘤患者建议予化学药物辅助治疗。替莫唑胺(TMZ)属新型口服烷化剂,其可以穿透血脑屏障到达肿瘤病灶,有效抑制胶质瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡,发挥抗胶质瘤作用,延长患者生存时间。然而,临床上GBM常出现替莫唑胺化疗耐药现象而导致胶质瘤复发,治疗失败。胶质瘤TMZ化疗耐药的分子机制目前仍未完全阐明。微小RNA(microRNAs,miRNAs)是这几年在真核生物中发现的,并且为一类由19-25个核苷酸组成的非编码RNA。前期研究表明miRNAs可作为细胞内重要的调控因子,其在肿瘤细胞的增殖具有癌基因或抑癌基因的作用,而在早期细胞的分化或者细胞的凋亡通路中亦扮演重要的角色。我们前期通过分析胶质瘤U251TR耐药细胞和U251非耐药细胞间miRNA芯片发现:miR-181a-5p在耐替莫唑胺胶质瘤细胞株中的表达水平较敏感细胞株显著降低。然而,miR-181a-5p在胶质瘤细胞化疗耐药中的调控作用及其分子机制,目前尚未见相关报道。综上所述,我们推测miR-181a-5p可能参与了胶质瘤细胞替莫唑胺耐药机制的过程。本课题旨在探讨miR-181a-5p对胶质瘤细胞替莫唑胺耐药性和侵袭力的调控作用。通过本课题的研究,阐明并完善临床胶质瘤细胞TMZ化疗耐药的具体分子机制;为下一步开展胶质瘤TMZ耐药的基础研究提供前期依据,为临床胶质瘤化疗耐药难题提供一种新的治疗思路和方案。方法:1.通过qRT-PCR技术,检测胶质瘤耐药细胞(U251TR)、亲本细胞(U251)、原发胶质瘤组织、化疗后复发胶质瘤组织中miR-181a-5p表达水平,明确miR-181a-5p与胶质瘤替莫唑胺化疗耐药的相关性。2.通过转染miR-181a-5p模拟物(mimics)和拮抗剂(inhibitors)分别过表达和抑制miR-181a-5p在胶质瘤细胞中表达,采用CCK-8法检测胶质瘤细胞替莫唑胺药物敏感性的变化,明确miR-181a-5p对胶质瘤细胞药物敏感性的影响。3.通过流式细胞凋亡检测技术,检测过表达miR-181a-5p对胶质瘤细胞凋亡率的改变,明确miR-181a-5p是否促进胶质瘤细胞发生凋亡。4.通过细胞划痕实验,观察miR-181a-5p对胶质瘤细胞迁移能力的影响。5.采用细胞transwell侵袭实验,检测miR-181a-5p对胶质瘤耐药细胞侵袭力的影响,探索miR-181a-5p是否参与调控胶质瘤细胞侵袭性。结果:1.采用qRT-PCR检测技术发现:miR-181a-5p在胶质瘤耐药细胞株和化疗后复发肿瘤组织中呈低表达,两组差异具有统计学意义(P0.05)。2.通过CCK-8药物敏感检测:与对照组相比较,转染了miR-181a-5pmimics的U251TR细胞对替莫唑胺的敏感性显著提高,其TMZ药物半抑制浓度(IC50值)显著降低(P0.005);相反,转染了miR-181a-5p inhibitors的U251敏感细胞对替莫唑胺的敏感性降低,IC50值显著升高(P0.001)。综上实验结果提示:通过转染技术上调miR-181a-5p表达,可增加GBM细胞对化疗药物替莫唑胺的敏感性;而下调miR-181a-5p的表达则显著降低胶质瘤细胞的药物敏感性。提示miR-181a-5p参与胶质瘤替莫唑胺耐药性的调控。3.采用流式细胞凋亡检测结果发现:与对照组相比较,过表达miR-181a-5p可诱导胶质瘤细胞(U251TR和U251)凋亡率增加,差异具有统计学意义(P0.05)。4.根据细胞划痕和transwell侵袭实验:与对照组相比,过表达miR-181a-5p细胞在24小时的细胞愈合率显著降低,差异具有统计学意义(P0.001);而抑制miR-181a-5p表达后细胞愈合率则显著升高(P0.001)。与control组相比较,过表达miR-181a-5p可显著降低胶质瘤细胞的侵袭能力(P0.001);然而,下调miR-181a-5p的表达则可显著提高GBM细胞的侵袭力(P0.001)。结论:1.MiR-181a-5p可增加胶质瘤细胞对化疗药物替莫唑胺的敏感性;可显著抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭能力。2.MiR-181a-5p可诱导胶质瘤细胞凋亡率增加。提示miR-181a-5p调控胶质瘤化疗药物敏感性有可能是通过影响细胞凋亡而实现的,其具体分子机制需进一步探讨。
【图文】：

海南医学院硕士学位论文2. 结果2.1 胶质瘤耐替莫唑胺细胞 U251TR 和亲本细胞 U251 细胞形态前期构建 U251TR 为渐次增加胶质瘤亲本细胞 U251 培养基中 TMZ 的浓度（约 1 年），并对其 TMZ 耐药的生物学特性进行了相应鉴定。如下图可以发现，U251TR 耐药株在细胞形态学方面，表现为失去细胞极性，并缺乏细胞与细胞间紧密连接及黏附连接；细胞呈松散的、长梭形间叶细胞形态；然而，U251 亲本细胞株则表现出鹅卵石上皮样形态，细胞与细胞间的连接亦比较紧密，表现为成团状簇拥生长（图 2.1）。

海南医学院硕士学位论文图 2.3 标记 FAM 片段转染 12 小时后对 U251TR 细胞转染效果注: （A）U251TR-mimic-NC 组，（B）U251TR-inhibitor-NC 组。Scale bar, 200 μm通过实时荧光定量 PCR 进一步检测胶质瘤细胞（U251/U251TR）转染前miR-181a-5p 的表达水平，结果提示：转染了 miR-181a-5p mimics 的 U251TR药细胞相比阴性对照组显著升高，组间的差异具有统计学意义（F=53.491P<0.05）；而转染了 miR-181a-5p inhibitors 的亲本 U251 敏感细胞相比阴性对组显著降低，，组间的差异亦具有统计学意义（F=67.832，P<0.05）（图 2.4）
【学位授予单位】：海南医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.4

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