大鼠P2家族基因表达分析及P2X7介导帕金森病发生的作用研究
发布时间：2020-06-10 22:51
【摘要】：帕金森病(PD)是一种高度异质性疾病,主要是由黑质多巴胺能神经元变性以及纹状体多巴胺含量明显减少所致。PD发病进程缓慢,病人表征无明显变化,不同的患者病情之间存在很大差异,目前尚未出现治愈方法。P2受体参与机体多种炎症、免疫机制等生理功能调控。其亚型P2X7受体属ATP生理性受体,可通过与胞外ATP受体结合可逆的开启阳离子通道。P2X7受体是介导各类痛觉调控机制的主力军,参与中枢神经系统外周伤害性炎症反应的放大、产生痛觉相关信号。PD疼痛的发生会伴随认知障碍的出现。近年来,有实验表明,P2X7受体在认知功能障碍中也具有一定的作用。结合本实验室前提工作,部分数据表明,PD痛阈低于正常大鼠,并伴有认知功能障碍。本研究利用生物信息学分析对大鼠P2受体基因初步鉴定分析表达,筛选出表达量高的P2受体亚型,通过6-OHDA诱导的PD模型大鼠,利用小动物行为分析系统记录帕金森大鼠在水迷宫行为学变化中的具体表现,从mRNA的角度继续阐明P2X7受体与帕金森认知功能调控中的互作机制,并且落脚于P2X7受体的生理特性,通过P2X7受体的激动剂BzATP和拮抗剂BBG,综合应用蛋白生物学等技术手段,在核酸、蛋白和整体动物等不同层面,通过免疫印迹技术对P2X7受体进行定性和半定量,着重于研究P2X7受体的表达对PD大鼠认知功能障碍的作用及影响。以丰富PD认知功能障碍的作用机理,旨在为临床上治疗PD病人认知功能障碍提供科学的实验依据,也为探明认知功能调控生理生化机制奠定基础。主要结果如下:1.激活或抑制P2X7受体诱导PD大鼠认知功能在行为表现上的变化PD模型大鼠认知功能障碍明显大于正常大鼠,通过BBG给药后,PD组学习记忆功能增强,在有效区停留时间延长;经过BzATP给药处理后,PD组的认知功能障碍加重,在定位航行实验中,BzATP组寻找并爬上平台的时间高于其余组的大鼠,表明激活P2X7受体可加重PD组的认知功能障碍。2.P2X7受体参与了PD大鼠认知功能障碍的变化调控对各组海马组织P2受体进行PCR扩增检测发现:仅P2X7受体的表达较显著,其余P2受体亚型表达效果不同。BzATP组的PD模型大鼠海马组织的P2X7受体表达量最高,而BBG组则低于PD组模型大鼠海马中P2X7受体的表达量。对各组海马组织蛋白中P2X7受体做免疫印迹实验后,发现P2X7受体在BBG组表达量较PD组下调,BzATP组大鼠海马组织表达的蛋白量较PD组上调。通过qRT-PCR和免疫印迹实验,验证了BzATP和BBG可以有效激活和抑制PD大鼠海马组织中P2X7受体的表达;结果表明P2X7受体在PD大鼠海马组织的mRNA水平和蛋白水平表达结果相似,P2X7受体可能在PD模型大鼠认知功能障碍中起负反馈调节作用。
【图文】：
图 1.1 帕金森的发病机制示意图Fig. 1.1 Pathogenesis of Parkinson's diseasePD 的潜在发病机制尚未完全阐明，但有几个关键机制与此有关，包括(1)神经炎症；(2)N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体介导的兴奋性毒性；(3)由于 Cav1.3 通道表达增加而改变钙稳态；(4)线粒体功能障碍、氧化应激和凋亡、细胞死亡；(5)神经营养支持缺失；(6)α-突触核蛋白（α-syn）折叠错误、积累和聚集成毒性低聚物，，并通过类似朊病毒的机制传播；(7)增加富含亮氨酸的重复激酶 2(lrrk2)激酶活性。ATP=腺苷 5′-三磷酸；ca2+=钙；GDNF=神经胶质源性神经营养因子；GRFα=GDNF 家族受体 α；JNK=C-JUN N 末端激酶；RET=在转染受体酪氨酸激酶期间重新排列；ROS=活性氧物种。尖箭头表示正调节，钝箭头表示负调节。运动障碍伴随着情感和情绪的障碍，Benzagmout 等人利用血氧水平依赖的功能性磁共振成像对 PD 患者进行情绪评估，结果显示在枕叶-颞皮层、岛叶、球体功能控制过程中，参与情绪加工的前额叶皮层、基底节区和顶叶皮层被激活，产生的情绪会激发更多的情绪。与情绪障碍相关的 PD 被越来越多地认为是致残性的运动症状[9]。这些发现有助于临床医生认识 PD 患者的情绪障碍，从而更早的对病情做出
2.3.1 大鼠 P2 受体的染色体定位分析在 RGD 大鼠基因数据库中鉴定到 P2 家族 15 个基因的基本信息，并对染色体进行初步定位，得知 P2 家族基因存在于 1 号、2 号、3 号、10 号、11 号、12 号以及 X 染色体上；P2X 受体亚型的外显子数量多，为 12~14 个，P2Y 受体亚型的外显子数量少，P2Y1 和 P2Y13 的外显子数仅为 2，P2Y6 有 8 个外显子。通过 MG2C 软件，进一步对 P2 家族基因的染色体进行定位，结果如图 2.3.1 所示。利用 expasy在线软件预测大鼠 P2 受体的等电点，结合大鼠 P2 受体的染色体信息，得到表 2-5。P2Y 受体普遍比 P2X 受体的等电点高。除 P2Y4 和 P2Y10 位于 X 染色体上，其余基因皆位于常染色体上。且 2 号染色体上分布的基因最多：P2Y1、P2Y12、P2Y13、P2Y14，出现了基因聚类现象；12 号染色体上分布的基因较多，为 P2X2、P2X4、P2X7；其余染色体上分布的基因为 1~2 条。此外，P2Y2 和 P2Y6、P2X1 和 P2X5也出现了基因聚类现象，分别紧密的排列在 1 号、10 号染色体上。
【学位授予单位】：延安大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R742.5
【图文】：
图 1.1 帕金森的发病机制示意图Fig. 1.1 Pathogenesis of Parkinson's diseasePD 的潜在发病机制尚未完全阐明，但有几个关键机制与此有关，包括(1)神经炎症；(2)N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体介导的兴奋性毒性；(3)由于 Cav1.3 通道表达增加而改变钙稳态；(4)线粒体功能障碍、氧化应激和凋亡、细胞死亡；(5)神经营养支持缺失；(6)α-突触核蛋白（α-syn）折叠错误、积累和聚集成毒性低聚物，，并通过类似朊病毒的机制传播；(7)增加富含亮氨酸的重复激酶 2(lrrk2)激酶活性。ATP=腺苷 5′-三磷酸；ca2+=钙；GDNF=神经胶质源性神经营养因子；GRFα=GDNF 家族受体 α；JNK=C-JUN N 末端激酶；RET=在转染受体酪氨酸激酶期间重新排列；ROS=活性氧物种。尖箭头表示正调节，钝箭头表示负调节。运动障碍伴随着情感和情绪的障碍，Benzagmout 等人利用血氧水平依赖的功能性磁共振成像对 PD 患者进行情绪评估，结果显示在枕叶-颞皮层、岛叶、球体功能控制过程中，参与情绪加工的前额叶皮层、基底节区和顶叶皮层被激活，产生的情绪会激发更多的情绪。与情绪障碍相关的 PD 被越来越多地认为是致残性的运动症状[9]。这些发现有助于临床医生认识 PD 患者的情绪障碍，从而更早的对病情做出
2.3.1 大鼠 P2 受体的染色体定位分析在 RGD 大鼠基因数据库中鉴定到 P2 家族 15 个基因的基本信息，并对染色体进行初步定位，得知 P2 家族基因存在于 1 号、2 号、3 号、10 号、11 号、12 号以及 X 染色体上；P2X 受体亚型的外显子数量多，为 12~14 个，P2Y 受体亚型的外显子数量少，P2Y1 和 P2Y13 的外显子数仅为 2，P2Y6 有 8 个外显子。通过 MG2C 软件，进一步对 P2 家族基因的染色体进行定位，结果如图 2.3.1 所示。利用 expasy在线软件预测大鼠 P2 受体的等电点，结合大鼠 P2 受体的染色体信息，得到表 2-5。P2Y 受体普遍比 P2X 受体的等电点高。除 P2Y4 和 P2Y10 位于 X 染色体上，其余基因皆位于常染色体上。且 2 号染色体上分布的基因最多：P2Y1、P2Y12、P2Y13、P2Y14，出现了基因聚类现象；12 号染色体上分布的基因较多，为 P2X2、P2X4、P2X7；其余染色体上分布的基因为 1~2 条。此外，P2Y2 和 P2Y6、P2X1 和 P2X5也出现了基因聚类现象，分别紧密的排列在 1 号、10 号染色体上。
【学位授予单位】：延安大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R742.5
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1 姜威;李月玲;俞明;陈R
本文编号：2706972
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