短暂性全脑缺血后海马CA1区细胞骨架的相关变化

发布时间：2020-06-11 03:28

【摘要】：目的:脑缺血损伤是一种由多因素引起的神经疾病,常常会导致认知和记忆障碍,至今尚无有效的疗法。脑缺血会引起海马神经元死亡和细胞骨架系统异常。到目前为止,脑缺血后细胞骨架在神经元死亡进程中的具体变化仍不清楚。微管和肌动蛋白纤维(F-actin)是两种重要的细胞骨架,在神经元生长发育过程中扮演着重要的角色。本课题采用短暂性四动脉全脑缺血模型,检测微管和肌动蛋白纤维在缺血再灌注不同时间点的形态学变化,同时检测微管和肌动蛋白纤维相关调节蛋白的表达情况,从而探讨缺血再灌注之后微管和肌动蛋白纤维在神经元延迟性死亡进程中的变化规律。方法:本实验采用短暂性四动脉全脑缺血13min再灌注模型,通过NeuN染色和F-JB染色检测神经元损伤情况,应用鬼笔环肽特异性检测海马中F-actin的变化,应用MAP2和β-Tubulin检测海马中微管的变化;应用western blot技术检测全海马中cofilin、p-cofilin、β-Tubulin以及acetylatedαTubulin蛋白的表达情况。在此基础上通过体外实验直接检测微管和肌动蛋白纤维的形态学变化,从整体上探讨缺血再灌注后微管和F-actin在海马神经元延迟性死亡进程中的变化规律。结果:1、NeuN、F-JB以及MAP2免疫荧光染色结果显示:海马CA1区锥体神经元在缺血再灌注第2天死亡,随着时间的延长逐渐加重,在缺血再灌注第7天神经元死亡数量达到最大。2、鬼笔环肽检测技术揭示F-actin降解进程与海马神经元死亡进程一致。海马CA1区F-actin在缺血再灌注第2天明显损伤;在缺血再灌注第3天到第7天,F-actin损伤逐渐加重。此外在缺血再灌注第2天到第3天,海马CA1区辐射层中的F-actin典型的点状结构消失。3、Western blot检测cofilin和p-cofilin蛋白表达情况,结果显示:cofilin的表达水平在缺血再灌注第3天和第7天逐渐增高,然而p-cofilin的表达水平却逐渐降低。4、β-Tubulin的免疫荧光染色结果显示:与假手术组相比,海马CA1区辐射层中β-Tubulin的表达在缺血再灌注第1天轻微下降,第2天显著降低,之后进行性减少并消失。5、Western blot检测β-Tubulin和acetylatedαTubulin蛋白表达情况,结果显示:与假手术组相比,缺血组全海马中β-Tubulin的蛋白表达水平变化并不显著,但是acetylatedαTubulin的蛋白表达水平却在缺血再灌注第3天降低,在缺血再灌注第7天显著减少。6、体外实验结果显示:海马神经元用细胞松弛素D处理后,F-actin发生降解,MAP2相应减少,随着作用时间的延长,二者的损伤情况逐渐加重;海马神经元用诺考达唑处理后,MAP2和F-actin均减少,并随着作用时间的延长逐渐加重。结论:1、全脑缺血再灌注后,F-actin和微管进行性解聚,其空间演变和时间变化与海马CA1区神经元损伤相一致。2、缺血再灌注后激活的cofilin可能参与F-actin的解聚。3、微管乙酰化表达水平在缺血再灌注后降低,可能与微管的断裂有关。
【图文】：

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H 图-N 图为 F-JB 染色，O 图-U 图为 MAP2 染色。Scale Bars：500μm。海马 CA1 区锥体层中 NeuN 的免疫荧光在假手术组中很容易检测到，但是在缺血再灌注之后却逐渐减少(A 图-G 图)。NeuN 的荧光强度和阳性颗粒在缺血再灌注第 2 天到第 3 天显著降低，在第 7 天达到顶峰，意味着此时神经元死亡最多。F-JB 染色显示在缺血再灌注第 2 天出现 F-JB 阳性细胞，一直持续到缺血再灌注第 7 天(H 图-N 图)。海马 CA1 区和门区MAP2 的荧光强度在缺血再灌注之后随着时间的推移逐渐减少(O 图-U 图)。

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图 3.2 缺血再灌注不同时期海马 CA1 区的高倍镜照片。A 图-G 图为 NeuN 染色，H 图-N 图为 F-JB 染色，O 图-U 图为 MAP2 染色。Scale bar：50μm。在假手术组中，海马锥体层中 NeuN 的阳性染色很容易检测到，但是缺血再灌注之后，NeuN 荧光强度却逐渐下降，其中在缺血再灌注 7 天时降到最低(A 图-G 图)。海马 CA1 锥体层在缺血再灌注第 2 天有很多 F-JB 阳性细胞，，一直持续到缺血再灌注第 7 天(H 图-N 图)。海马 CA1 区 MAP2 的荧光强度在缺血再灌注之后随着时间的推移逐渐减少(O 图-U 图)。V 图是缺血再灌注不同时间点海马 CA1 区锥体层 NeuN 的阳性细胞的平均数量统计结
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R743

【参考文献】