【摘要】：背景原发性家族性脑钙化(Primary Familial Brain Calcification,PFBC),又称为特发性基底节区钙化(Idiopathic Basal Ganglia Calcification,IBGC)、Fahr病,是一种罕见的神经遗传退行性疾病,临床表现多样,主要有肌张力障碍、头痛、痴呆、抑郁等。影像学表现以广泛的脑内多发对称性钙化为主要特征,多位于双侧尾状核、豆状核、丘脑、脑干及小脑齿状核等部位,但受累个体血清钙磷水平、甲状腺功能、甲状旁腺功能均正常,这是PFBC区别于其他脑钙化疾病的主要鉴别点。目前已知多个基因突变可导致该疾病发生和发展,有:SLC20A2、PDGFB、PDGFRB和XPR1等。位于8号染色体上的SLC20A2是该病的主要致病基因,已发现该基因多个位点突变可导致PFBC发生。PFBC的确切发病机制尚未完全阐明,多与钙磷代谢失衡相关。既往的研究表明在生理条件下,脑实质中的无机磷酸盐(Inorganic Phosphate,Pi)被无机磷酸盐转运体2(Inorganic Phosphate Transporter 2,Pi T-2)摄取进入脑细胞内,Pi通过异嗜性和多嗜性逆转录病毒受体1(Xenotropic and Polytropic Retrovirus Receptor1,XPR1)从脑细胞内排出。在病理条件下,SLC20A2基因发生突变,导致其表达的Pi T-2结构和功能发生改变,向胞内摄取Pi的能力减弱,Pi在脑实质积聚,胞内低磷,进而导致钙沉积。线粒体和高尔基体是细胞内重要的细胞器,同时对钙磷变化较为敏感。已有研究表明,线粒体和高尔基体结构和功能的异常参与了阿兹海默病(Alzheimer’s Disease,AD)、帕金森氏病(Parkinson’s Disease,PD)、脊髓小脑共济失调(Spinalcerebellar Ataxia,SCA)、肌萎缩脊髓侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)等神经退行性疾病的发病过程,异常线粒体和高尔基体可能是神经退行性疾病早期的病理表现。而在PFBC发病过程中线粒体和高尔基体的变化鲜有报道。目前,PFBC患者来源的神经元不易获得,对该病的研究缺乏可靠的细胞模型,而近年来发展迅猛的体细胞重编程为干细胞技术,为获得患者来源的疾病细胞模型提供了新的方向。诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cell,i PSC)是与胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell,ESC)具有相似形态和生物功能的一类细胞,在2006年,日本科学家山中伸弥通过携带重编程因子基因的逆转录病毒转染体细胞的方法,首次成功诱导体细胞重编程为i PS细胞。并对其形态和功能进行观察和检测,发现与胚胎干细胞形态类似,并且i PS细胞在体外也可进一步分化为各类体细胞,为探究疾病的发病机制、细胞移植和药物筛选提供理想而可靠的细胞模型。本研究通过搜集一例PFBC患者所在家系,应用Sanger测序技术确定其携带的致病基因,获取患者来源的体细胞,重编程为诱导多能干细胞,进而分化为神经前体细胞、多巴胺能神经元和星形胶质细胞,并对不同种类细胞凋亡水平及线粒体和高尔基体的形态进行检测与分析,发现了PFBC致病基因新的位点突变,成功地构建了健康志愿者和PFBC患者来源的诱导多能干细胞系、神经前体细胞系、多巴胺能神经元和星形胶质细胞,并初步探讨了PFBC的发病机制,为后续进一步探讨该病的发病机制和潜在治疗措施等奠定了基础。目的明确所收集家系所携带的致病基因,构建健康志愿者和患者来源的诱导多能干细胞,并初步探讨了原发性家族性脑钙化的发病机制。方法1.利用Sanger测序技术确定该原发性家族性脑钙化家系的致病基因;2.运用重编程技术构建健康志愿者和PFBC患者来源的诱导多能干细胞;3.体外定向分化健康志愿者和PFBC患者疾病特异性i PSCs为神经前体细胞、多巴胺能神经元和星形胶质细胞;4.应用流式细胞术、免疫荧光染色等实验技术,初步探究SLC20A2基因突变在PFBC发病机制中的作用。结果1.Sanger测序结果显示该家系携带一个PFBC已知相关基因SLC20A2新发位点突变(c.613GA,p.Val205Met);2.成功获得健康志愿者和患者来源体细胞,并成功构建野生型和患者特异性诱导多能干细胞系;3.健康志愿者和PFBC患者来源的诱导多能干细胞(i PSCs)具有胚胎干细胞样形态,高表达干细胞标志物OCT4、Nanog、SOX2和TRA-1-60,具有正常的二倍体核型,在NOD-SCID小鼠体内能成功的分化为具有三胚层的畸胎瘤,患者来源的诱导多能干细胞(i PSCs)仍携带致病的SLC20A2基因;4.成功定向诱导i PS细胞分化为神经前体细胞,进一步分化为多巴胺能神经元和星形胶质细胞,免疫荧光染色显示其分别表达多巴胺能神经元标志蛋白(TH和Beta-Tubulin III)和星形胶质细胞标志蛋白(GFAP);5.在对线粒体和高尔基体形态的检测中,发现神经前体细胞、多巴胺能神经元和星形胶质细胞中存在线粒体和高尔基体形态和结构破坏;6.PFBC患者来源的神经前体细胞、多巴胺能神经元和星形胶质细胞凋亡水平高于健康志愿者来源的同类细胞。结论1.SLC20A2基因新发位点突变c.613GA突变可能导致原发性家族性脑钙化。2.患者来源组神经细胞线粒体和高尔基体形态和结构异常,可能参与PFBC的发病。3.SLC20A2基因c.613GA突变导致神经细胞凋亡水平增高,可能导致疾病的发生。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R742
【图文】：
功收集先证者的临床资料者，男，13 岁，慢性病程，5 年前发现脑内多发钙化，现以年”为主诉入院，主要表现为重复性动作，自言自语，伴有续数十秒至 2 分钟缓解，无大小便失禁、明显肢体抽搐等正常范围内，甲状旁腺素轻微升高（66.4pg/mL>65 pg/mL)：颅内多发钙化，双侧基底节区、双侧丘脑、齿状核异常搐史，其父脑内存在多发钙化灶（详见图 1）。
3.2 Sanger 测序发现先证者及其父亲携带 SLC20A2 基因新发位点突变（c.613G>A）运用 Sanger 测序的方法筛选该家系是否携带目前已知的 PFBC 相关基因（SLA20A2,SLA20A1,XPR1,PDGFB,PDGFRB,ISG15)，共筛选出 7 个两名患者共同携带可疑致病变异，包括一个 SLC20A2 基因的杂合子突变(c.613G>A,p.Val205Met)。由于 SLC20A2 基因 c.613G>A 突变是一个错义突变，可能会改变SLC20A2 蛋白的结构及功能，我们推测该突变最为可能是该家系的致病突变，进行后续的验证实验（详见图 2）。
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本文编号：
2717214
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