Nurr1基因对神经干细胞与小胶质细胞体外Transwell共培养的影响

发布时间：2020-06-22 06:49

【摘要】：[目的]体外研究神经干细胞与小胶质细胞均过表达Nurr1基因后在Transwell共培养中的相互作用及影响。[方法]1.原代小胶质细胞的培养:取新生24-48小时内的SD大鼠大脑皮层组织,用角膜剪将脑组织切碎,然后用2 mL的胰蛋白酶/EDTA(0.05%/0.02%)进行酶解。用含10%胎牛血清的DMEM培养液(1:1)中止消化,用70μm细胞滤器过滤后获得单细胞悬液。按5×106/mL的细胞密度接种后在小胶质细胞完全培养液中培养,混合培养14天后通过拍打法分离纯化,并经CD11b免疫荧光鉴定。2.原代神经干细胞的培养:取孕12.5-14.5天的SD大鼠胎鼠,解剖分离获取中脑腹侧组织。用角膜剪剪碎后用1mL灭菌移液管反复机械吹打数次,经70μm细胞滤器过滤获得单细胞悬液。按2×105/mL的细胞密度接种于培养瓶,加入含表皮生长因子(epidermal grouth factor,EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的神经干细胞完全培养液(EGF与bFGF终浓度均为20ng/mL)。神经干细胞原代培养7天后离心收集神经球,进行免疫荧光鉴定及分化培养鉴定。3.设计Nurr1基因引物并经PCR扩增,利用Xba Ⅰ和Not Ⅰ酶切基因Nurr1和载体 pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP(或 pCDH-CMV-MCS-EF1-copRFP),利用T4连接酶把己酶切的基因Nurr1和己酶切的载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP(或 pCDH-CMV-MCS-EF1-copRFP)连接起来,完成慢病毒表达载体的构建。最终获得慢病毒载体pCDH-copRFP-Nurr1及pCDH-copGFP-Nurr1,分别用于神经干细胞与小胶质细胞的慢病毒感染。4.构建Transwell共培养体系:Transwell上室用于小胶质细胞的培养,下室用于神经干细胞的培养。将神经干细胞与小胶质细胞随机分成以下6组进行共培养:神经干细胞单独培养组(mNSC组,Control组)、神经干细胞与小胶质细胞共培养组(mNSC+MG组)、神经干细胞与过表达Nurr1的小胶质细胞共培养组(mNSC+NMG组)、过表达Nurr1的神经干细胞组(NmNSC组)、过表达Nurr1的神经干细胞与小胶质细胞共培养组(NmNSC+MG组)和过表达Nurr1的神经干细胞与过表达Nurr1的小胶质细胞共培养组(NmNSC+NMG组)。培养3,6和9天后分别收集各组mNSC,应用Western blot,RT-PCR及免疫荧光检测各组Otx2,Pitx3,TH和DAT的表达情况。[结果]1.体外成功培养原代神经干细胞与小胶质细胞,免疫荧光鉴定神经干细胞Nestin阳性,分化培养后分化细胞分别呈Tuj1和GFAP阳性。小胶质细胞经免疫荧光鉴定呈CD1 1b阳性。2.经慢病毒感染成功使神经干细胞与小胶质细胞分别过表达Nurr1基因,神经干细胞过表达Nurr1基因后分化成DA神经元的比例增加;小胶质细胞过表达Nurr1基因后炎症因子分泌减少,神经营养因子分泌增加。3.在Transwell神经干细胞与小胶质细胞共培养中,神经干细胞与小胶质细胞联合过表达Nurr1基因组DA神经元相关标记物(Otx2,Pitx3,TH和DAT)较其余实验组明显表达增多,说明神经干细胞与小胶质细胞均过表达Nurr1基因后共培养,可促进神经干细胞向DA神经元分化。[结论]Nurr1基因在体外神经干细胞与小胶质细胞共培养中,能增加小胶质细胞神经营养因子的分泌,减少炎症因子分泌,促进神经干细胞向DA神经元分化。
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R742.5
【图文】：

结构图,共培养,组间,模式图

５．神经干细胞与小胶质细胞的Ｉｔａｎｓｗｅｌｌ共培养逡逑５．１邋Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ共培养小室逡逑在本研究中，我们采用Ｃｏｍｉｎｇ２４孔板Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ共培养小室（结构图见图２）逡逑进行神经干细胞与小胶质细胞的体外共培养。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上、下小室间膜的孔径逡逑为０．４ｍｍ，细胞不能透过，而细胞分泌的一些因子能透过此孔径，从而相互作用。逡逑在本实验中，我们将小胶质细胞置于上层小室（４．５ｘｌ０５／ｍＬ），神经千细胞置于逡逑下层小室（１．５ｘｌ0５／ｍＬ）。逡逑５．２神经干细胞与小胶质细胞Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ共培养过程逡逑将神经干细胞与小胶质细胞随机分成以下６组进行共培养：神经干细胞单独逡逑培养组（ｍＮＳＣ组，Ｃｏｎｔｒｏｌ组）、神经干细胞与小胶质细胞共培养组（ｍＮＳＣ＋ＭＧ逡逑组）、神经干细胞与过表达Ｎｕｒｒｌ的小胶质细胞共培养组（ｍＮＳＣ＋ＮＭＧ组）、过逡逑表达Ｎｕｒｒｌ的神经干细胞组（ＮｍＮＳＣ组）、过表达Ｎｕｒｒｌ的神经干细胞与小胶质逡逑细胞共培养组（ＮｍＮＳＣ＋ＭＧ组）和过表达Ｎｕｒｒｌ的神经干细胞与过表达Ｎｕｒｒｌ逡逑的小胶质细胞共培养组（ＮｍＮＳＣ＋ＮＭＧ组）。根据Ｚｕｊｏｖｉｃ，Ｖ．等的研宄［２８］，我们逡逑将神经干细胞与小胶质细胞Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ共培养的比例定为２：１，分别将细胞接种于逡逑上下小室。神经干细胞与小胶质细胞分别共培养３，６和９天后收集下室的神经干逡逑细胞，应用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ，ＲＴ－ＰＣＲ及免疫荧光检测各组神经干细胞间Ｏｔｘ２，邋Ｐｉｔｘ３，逡逑ＴＨ和ＤＡＴ的表达情况。逡逑

神经干细胞,过表达,标尺,慢病毒感染

神经干细胞（神经球）经慢病毒感染培养７２小时后，荧光显微镜下观察发逡逑现，大部分神经球均表达绿色荧光（ＧＦＰ），且其中有些神经球已渐自行贴壁分逡逑化（图４Ａ－Ｂ）。为进一步检测过表达Ｎｕｒｒｌ对神经干细胞分化的影响，我们分别逡逑用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ及ＲＴ－ＰＣＲ检测Ｎｕｒｒｌ组及空载体组间Ｎｕｒｒｌ、ＴＨ及ＤＡＴ表达情逡逑况。实验数据表明，与空载体组相比较，Ｎｕｒｒｌ组Ｎｕｒｒｌ的ｘｎＲＮＡ及蛋白水平表逡逑达均明显上调，有统计学差异（图４Ｃ－Ｆ）。说明神经千细胞经慢病毒感染７２小逡逑时后成功过表达了邋Ｎｕｒｒｌ。除了邋Ｎｕｒｒｌ水平外，我们进一步用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ及逡逑ＲＴ－ＰＣＲ检测ＴＨ及ＤＡＴ在两组间的表达情况，数据分析发现ＴＨ及ＤＡＴ在Ｎｕｒｒｌ逡逑组的表达水平也均上调，说明神经干细胞过表达Ｎｕｒｒｌ后其分化成的ＤＡ神经元逡逑比例也相应上调（图５）。逡逑２４逡逑

【参考文献】