MSC中抑制PHD2的表达对缺血性脑卒中治疗的研究

发布时间：2020-06-23 06:49

【摘要】：研究背景脑卒中(Stroke)是严重危害人类生命安全和健康的急性血液循环障碍性疾病,具有高发病率、高致残率和高死亡率的“三高”特征,危害极大。目前,脑卒中已经成为全世界继恶性肿瘤后的第二大致死性疾病和首位致残性疾病,其中70%以上为缺血性脑卒中。目前,只有重组组织型纤溶酶原激活剂(r-tPA)是唯一通过FDA认证的急性缺血性脑卒中的治疗药物,却受到了治疗时间窗、颅内出血风险以及再灌注损伤的限制,只有少于10%的急性缺血性脑卒中病人有血管再通治疗的适应证。并且,即使及时接受了再通治疗的急性缺血性脑卒中病人也面临长期残疾的风险。因此,脑卒中后的修复治疗就显得极为重要。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一类可以自我更新并具有多向分化潜能的多能干细胞,可以定向分化为骨、脂肪、软骨以及骨髓的基质细胞,在特定条件下可以分化为神经细胞、胶质细胞以及内皮细胞。MSCs在多项疾病中的治疗作用引起了世界范围内的关注和广泛研究。虽然MSCs在临床应用的安全性上得到了肯定,但是在疗效上却存在了一定的争议,这可能与其较低的靶向迁移效率以及移植后的存活时间短有关。本实验拟构建MRI可视化siRNA纳米载体,递载靶向PHD2的siRNA到MSCs中,特异性的抑制MSCs中PHD2蛋白的表达,提高MSCs的迁移能力和存活能力,进而增强MSCs对缺血性脑卒中的治疗效果。同时,实验采用生物发光和磁共振结合的双模态成像方式对MSCs移植后的体内归巢、迁移和存活状态进行动态、无创、连续的活体示踪。第一部分MRI可视化si RNA纳米载体制备及鉴定目的:本实验旨在开发同时具有si RNA递载和磁共振(magnetic resonance imaging,MRI)示踪性能的磁性纳米载体,验证载体对si RNA的聚合、释放、保护、递载作用以及MRI成像性能,为后续si RNA递载和MSCs体内磁共振标记示踪一体化奠定基础。方法:用甲基化修饰的两亲性低分子量聚乙烯亚胺(amphiphilic low molecular weight polyethylenimine,Alkyl-PEI)包裹氧化铁纳米颗粒,构建MRI可视化纳米载体。通过动态光散射(Dynamic light scattering,DLS),、透射电子显微镜(Transmission electron microscope,TEM)、zeta-potential等手段对纳米载体的粒径以及纳米载体对si RNA的聚合的特性进行表征。通过凝胶电泳实验、肝素解络合实验、血清保护实验进一步验证纳米载体对si RNA的聚合、释放以及保护作用。采用磁共振扫描验证纳米载体的磁共振成像能力。FITC荧光染料标记si RNA,通过纳米载体递载si RNA至MSCs 6h后,进行普鲁士蓝染色以及荧光成像,验证纳米载体对si RNA的递载效率。采用CCK-8实验,分别观测MSCs与纳米载体/si RNA复合物共同孵育6h,12h,24h,48h,72h后的细胞存活率,从而检测纳米载体对MSCs是否具有毒性。结果:DLS结果表明构建的纳米载体水合粒径在80-120nm之间。TEM结果显示纳米载体是以氧化铁纳米簇为核心的单分散结构。体外磁共振结果表明,纳米载体的r2值为549.7 m M-1S-1,T2WI图像信号随着纳米载体浓度的增加而逐渐降低,表明纳米载体具有很好的磁共振成像性能,可以用于对MSCs的磁共振标记示踪。Zeta-potential随着纳米载体和si RNA的氮/核酸磷酸(N/P)比例而增加,说明纳米载体可以有效的聚集搭载si RNA。凝胶电泳滞留实验结果显示,随着N/P比例增大,纳米载体聚合si RNA的效率逐渐增高,从而阻止si RNA进入凝胶中显像。肝素解络合实验显示,纳米载体聚合si RNA后,在混合物中加入肝素,si RNA可以成功的从纳米载体上释放。血清保护实验结果表明纳米载体可以有效保护si RNA,防止其降解。CCK-8实验结果表明纳米载体递载si RNA至MSCs中,对MSCs无明显的细胞毒性。结论:实验成功构建了低毒性、高转染效率的MRI可视化si RNA递载系统,实现了si RNA递载和MSCs标记示踪的“一石二鸟”的作用。第二部分抑制PHD2蛋白表达促进MSCs治疗作用的体外研究目的:实验旨在通过MRI可视化纳米载体,递载靶向脯氨酸羟化酶2(HIF-prolyl hydroxylase 2,PHD2)的si RNA到MSCs中,特异性的抑制MSCs中PHD2蛋白的表达,探究抑制PHD2表达对MSCs迁移、存活能力的影响及其相关机制。方法:5×10^5 MSCs种植于6孔板中,将纳米载体与siRNA(对照siRNA:siCON;靶向PHD2 si RNA:si PHD2)混合均匀后与MSCs共孵育6h,更换新鲜培养基继续培养至48h,采用western blot方法测定MSCs中PHD2,CXCR4,HIF-1α蛋白表达情况。通过transwell实验测定PHD2蛋白表达抑制后,MSCs迁移能力的改变;采用双氧水(H2O2)凋亡实验观测PHD2蛋白表达抑制后,MSCs在氧化应激环境中的存活情况。结果:通过纳米载体递载si PHD2到MSCs中后,可以有效抑制MSCs中PHD2蛋白的表达。MSCs中PHD2蛋白表达抑制后,与MSCs迁移能力相关的CXCR4蛋白以及与存活能力相关的HIF-1α蛋白表达明显升高。Transwell实验显示,相对于si CON-MSCs(转染对照si RNA的MSCs)组,si PHD2-MSCs(转染靶向PHD2 si RNA的MSCs)组有更多的细胞迁移到下层小室;而H2O2凋亡实验则表明,加入H2O2后6小时,si PHD2-MSCs组的生物发光强度明显高于si CON-MSCs组。结论:体外实验结果证明,纳米载体递载靶向PHD2的si RNA到MSCs中,可有效抑制PHD2的表达。而抑制MSCs中PHD2蛋白的表达,可以通过提高CXCR4蛋白和HIF-1α蛋白的表达,促进MSCs的迁移、存活能力。第三部分抑制PHD2蛋白表达促进MSCs对缺血性脑卒中治疗效果的体内研究目的:应用携带双报告基因的病毒粒子和MRI可视化纳米载体对MSCs进行标记。通过生物发光(Bioluminescence imaging,BLI)和MRI的双模态成像对移植的MSCs进行体内动态示踪。同时,探究PHD2蛋白表达抑制后,MSCs对缺血性脑卒中治疗效果的改变,探究MSCs移植治疗缺血性脑卒中的新方法,新思路。方法:将携带双报告基因的病毒粒子与polybrene(5 mg/m L)加入到MSCs培养基中,6h后换新鲜培养基继续培养,72小时后传代。取不同浓度的MSCs种植于12孔板中进行BLI检测,测定细胞数量与发光强度的相关性。在光化学法脑卒中模型建立1天后,经心脏输注1×10^6 MSCs至小鼠体内,在MSCs移植后不同时间点进行BLI和MRI检测,动态示踪MSCs移植后在体内的归巢、迁移和存活状况。在MSCs移植7天后,通过T2WI扫描监测缺血梗死灶面积的改变,通过western blot检测脑组织中BNDF,VEGF的表达情况,通过CD31和DCX免疫组化染色测定血管新生和神经新生情况,通过普鲁士蓝染色确定MSCs存在于脑组织缺血周边区。MSCs移植后14天,通过DTI扫描监测定FA值以及纤维数目的改变;通过Neu N及MBP免疫染色测定神经修复及脑白质恢复情况。在脑卒中模型建立前1天及MSCs移植后1,3,7,14天分别进行m NSS和foot-faults行为学监测,测定小鼠脑卒中后的神经功能恢复情况。结果:MSCs生物发光强度与细胞数目有很高的一致性。MSCs移植后一天,BLI结果显示,si PHD-MSCs组迁移至脑卒中缺血区域的MSC数目明显增多。而在MSCs移植后第7天,si PHD2-MSCs组生物发光信号依然高于si CON-MSCs组。普鲁士蓝染色结果证明,MSCs移植后7天依然存在于脑组织缺血周边区。Western blot结果显示,MSCs移植后7天,si PHD2-MSCs治疗组脑组织中BDNF的表达明显升高,而VEGF的表达则没有显著差异。T2WI扫描结果显示si PHD2-MSCs治疗组脑卒中梗死面积明显减小。si PHD2-MSCs治疗组缺血周边区CD31和侧脑室下区DCX表达明显增多。MSCs移植后14天,DTI结果显示,si PHD2-MSCs组胼胝体区FA值明显增高,纤维数目显著增多,缺血周边区Neu N及MBP表达显著增高。结论:将生物发光和磁共振两种成像方式的有效结合,取长补短,可以对移植的MSCs进行体内动态观测,对MSCs移植治疗缺血性脑卒中具有指导意义。抑制PHD2蛋白表达可以通过增强MSCs细胞的迁移以及存活能力,提高MSCs对缺血性脑卒中的治疗效果。
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R743.3
【图文】：

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2．实验结果2.1 纳米载体的粒径测定我们采用TEM成像观测纳米载体的粒径，从图1A中可以看到，纳米载体形成以氧化铁为核心的纳米簇，保证了良好的磁共振成像效果，纳米载体呈均匀单一分布，粒径均匀，图B统计结果显示纳米载体的水合粒径在80-120nm。图1：Alkyl-PEI/SPIO纳米载体的粒径测定(A)纳米载体的TEM成像，纳米载体分布均匀单一，粒径均匀。（B）DLS结果显示，纳米载体的水合粒径为80-120nm。2.2 Alkyl-PEI/SPIO磁共振成像能力监测为检测纳米载体的磁共振成像能力，我们将不同浓度梯度的纳米载体置于磁共振中采集信号，磁共振成像结果显示，纳米载体的T2信号强度随纳米载体浓度增加而逐渐降低

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东南大学博士学位论文26图2: 纳米载体磁共振检测（A）不同浓度纳米载体的T2磁共振成像，纳米载体的T2信号随着浓度的增加而迅速降低。（B）不同浓度纳米载体的T2 mapping磁共振成像，纳米载体的浓度与其横向持续时间呈正相关。2.3 Alkyl-PEI/SPIO纳米载体聚合、释放、保护siRNA实验Alkyl-PEI/SPIO 与 siRNA 按照不同 N/P 比例混合后通过静电吸引形成Alkyl-SPIO/siRNA复合物。纳米载体与siRNA共孵育之后，其粒径和zeta-potential随纳米载体与siRNA的不同的N/P比例而变化，这一结果说明纳米载体可以有效的聚合siRNA,并且聚合的效率随不同的N/P比而变化（图3A）。凝胶滞留实验结果(图3B)显示，纳米载体聚合siRNA的能力随N/P比例增大而逐渐增强，在N/P比例为0，1

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