巨噬细胞亚型在实验性自身免疫性脑脊髓炎发病中的作用及其机制研究

发布时间：2020-06-24 16:39

【摘要】：多发性硬化是一种常见的导致中枢神经系统脱髓鞘的自身免疫性疾病,它以中枢神经系统的慢性炎症、白质脱髓鞘、轴突和神经元丢失为主要病理改变。实验性自身免疫性脑脊髓炎是MS的非常经典的动物模型,多年来广泛应用于MS的基础性研究。目前MS治疗包括干扰素β、糖皮质激素等,但这些药物只对部分患者有效且疗效不显著,免疫抑制剂等药物虽有显著疗效,但因副作用大严重限制了其临床应用,因此MS治疗一直是国内外研究的热点。巨噬细胞是重要的免疫细胞,在多发性硬化及实验性自身免疫性脑脊髓炎疾病的发生和发展中起到了重要的作用。巨噬细胞可分为M1型和M2型巨噬细胞,M1型是促炎型巨噬细胞,释放促炎因子,导致神经系统组织损伤,M2型是抗炎型巨噬细胞,具有抗炎并促进组织修复的作用。研究发现MS患者在疾病急性期大脑及脊髓内浸润的致炎细胞主要为促炎型M1细胞,不是抗炎型M2细胞,因此推论造成MS脑内炎症病变的主要致炎细胞是M1巨噬细胞/小胶质细胞。应用MRI监测小鼠脑内标记的M1/M2细胞示踪剂后发现,在严重复发型EAE小鼠脑内M1增多,EAE的复发明显,而小鼠脑中M2细胞增多则有利于EAE的缓解同时能够加强免疫调节。因此抑制M1,促进巨噬细胞向M2转化可能有助于MS的治疗。研究目的:研究巨噬细胞亚型在实验性自身免疫性脑脊髓炎发病的作用及其机制研究。建立EAE模型,观察(1)M1和M2细胞在EAE中的作用;(2)诱导M2细胞分化,过继转移M2,观察M2对EAE小鼠的治疗作用;(3)细胞内信号转导分子NF-κb对M1向M2转化的作用。研究方法:(1)用MOG35-55加完全弗氏佐剂(FCA)混合乳液,皮下注射C57BL/6小鼠,同时腹腔注射百日咳毒素(pertussis toxin,PTX)建立EAE模型;(2)观察M1、M2细胞在EAE中的作用:在发病不同时期取EAE小鼠(1)脊髓通过病理染色(HE和髓鞘染色),观察EAE小鼠脊髓炎症及髓鞘脱失的情况;(2)分离EAE小鼠脾脏,通过流式细胞术选取巨噬细胞(F4/80,CD11b)进行M1、M2表型测定(M1检测i NOS,CD40,M2检测Arg-1,CD206以鉴别M1和M2);(3)通过CBA方法检测EAE不同发病时期M1/M2细胞分泌炎性/抗炎性细胞因子;(3)诱导M2细胞分化,过继转移M2,观察M2对EAE小鼠的治疗作用:(1)取同品系小鼠骨髓干细胞,体外通过加入IL-4/M-CSF刺激骨髓干细胞朝M2方向转化;(2)经流式细胞仪确认M2细胞占有90%以上;(3)于EAE小鼠刚发病时回输M2细胞同时设立对照组,观察临床症状;(4)巨噬细胞对EAE治疗起效1-2周后,处死动物,小鼠脊髓进行病理染色(HE和髓鞘染色),分离脾脏巨噬细胞,进行巨噬细胞表型分析;(5)通过CBA方法检测M2细胞回输组与对照组高峰期M1/M2细胞分泌炎性/抗炎性细胞因子变化情况。(4)细胞内传导信号分子NF-κb对于M1转化至M2的作用:(1)观察EAE小鼠,检测病变不同时期脾脏中M1/M2的表型和功能,并通过蛋白质印迹法(Western blot)检测EAE小鼠脊髓中信号转导分子NF-κb的表达水平;(2)EAE小鼠应用NF-κb阻断剂进行预防和治疗,治疗后测定小鼠脊髓中信号转导分子NF-κb的表达水平,同时对不同时期小鼠脊髓进行病理染色(HE和髓鞘染色),同时取脾脏进行M1与M2表型与功能测定,了解NF-κb对巨噬细胞的分化的影响,以此判断细胞内传导信号分子活性不足能否使巨噬细胞处于中间状态,从而不能进一步分化成M1或M2。(3)通过CBA方法检测NF-κb阻断组与对照组不同发病时期M1/M2细胞分泌炎性/抗炎性细胞因子变化情况。(5)所有试验至少重复三次,获得的数据应用均数±标准差表示,两组之间的计量资料的均数比较用t检验,比较EAE组与不同时期及与治疗组之间的差异是否具有统计学意义,P0.05差异具有统计学意义结果:(1)MOG-35-55和CFA混悬后皮下注射能够有效地诱导C57BL/6小鼠成为EAE模型,在免疫后的第10天发病,第20天左右达高峰。(2)EAE组小鼠发病初期巨噬细胞增多(35.56±1.659%)其中M1比例增高(73.37±1.451%),M2比例较低(26.63±1.451%)随着病情发展M1比例降低(56.16±1.297%),M2逐渐增高(43.84±1.297%),高峰期升至最高,恢复期M2下降。细胞因子TNF,IL-6,IL-17A在发病初期增高,发病高峰期降低。(3)应用IL-4和M-CSF诱导骨髓干细胞分化M2巨噬细胞比例可达90%以上。(4)M2回输治疗组评分要低于EAE组(3.208±0.1145VS0.7500±0.3184),脾脏巨噬细胞减少,其中M2巨噬细胞减少明显,细胞因子IL-6,IL-17A和TNF在EAE组要高于M2细胞回输组。(5)应用NF-κb阻断剂后,小鼠脊髓中活性NF-κb活性降低。NF-κb预防组及NF-κb治疗组小鼠症状均轻于EAE组。阻断后小鼠脾脏中巨噬细胞生成及消耗均减少。结论:(1)MOG35-55加FCA混合乳液可成功诱导C57BL/6小鼠EAE模型。(2)巨噬细胞参与了EAE的发病过程,M1有促炎作用,加重EAE症状,M2具有抗炎作用,使EAE症状缓解。(3)应用IL-4和M-CSF能够成功在小鼠骨髓干细胞上诱导出M2巨噬细胞。(4)M2巨噬细胞回输减少小鼠脾脏巨噬细胞及促炎因子,可有效治疗EAE,。(5)NF-κb阻断剂BAY-11-7082可有效的阻断NF-κb 65磷酸化,抑制了巨噬细胞的生成及消耗。(6)阻断NF-κb通路可减轻EAE临床症状。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R744.5
【图文】：

巨噬细胞,白介素,免疫反应

图 1.1 巨噬细胞的产生及其分化巨噬细胞是非常重要的免疫细胞，它具有多种生物学功能，在免疫反应、炎症反应及细胞吞噬中起到了其他细胞不可替代的作用，它是先天免疫系统的一个重要组成部分，它不仅仅作用于人体的第一道防御，同时参与了后天防御系统的启动与调节。巨噬细胞可产生致炎的细胞因子与化学因子，包括肿瘤坏死因子α（TNF-α），趋化因子，白介素 1β（IL-1β）等，同时它还是最主要的吞噬细胞，参与清除了细胞凋亡细胞和组织碎片[26]。同时巨噬细胞通过表达抗炎因子（白介素 10，转化生长因子β，脂氧素等）对机体进行进行免疫调节。除了参与免疫反应，巨噬细胞还在组织重构方面发挥了重要的作用（乳腺，骨，肾脏，脑等）[27]，巨噬细胞的异常调节可导致自身免疫性疾病或炎症的持续存在[28]。

巨噬细胞,分型

图 1.2 巨噬细胞的分型极化及其在 MS 中的作用1.3.2 巨噬细胞向 M2 方向转化在体外，向巨噬细胞中加入 IFN-γ/脂多糖，可将其诱导成 M1 细胞, 而IL-4/IL-13 则可将其诱导成为 M2 细胞。然而，因为体内同时存在细胞因子，并且着环境的变化可发生改变，因此在炎症组织中，M1 和 M2 型细胞可同时存在。两型细胞的动态平衡对疾病的发展起着重要的作用，同时平衡的打破既有可能加剧的症状，也有可能促进 EAE 病情的恢复[65]。在 EAE 中，选择性输入 CD206+M2 细胞可抑制 EAE 病情的发展，其机制可M2 的抗炎作用有关。用巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、IIL-10、IL-13、TGF-β或地塞米松刺激巨噬细胞，巨噬细胞可表达更多 CD206CD163[47,66,67]，同时在已经激活的 M1 巨噬细胞上阻断 CD28 或 CD40/CD40L 信号中枢神经系统里可减少 T 细胞的激活，减轻 EAE 的症状[68]。同时选择性的消除星

【参考文献】