癫痫大鼠腹外侧中脑导水管周围灰质-脚桥核神经传导通路的初步研究

发布时间：2020-06-25 00:32

【摘要】：目的:通过腹腔注射(Intraperitoneal,i.p)匹罗卡品诱导癫痫持续状态(Status Epilepticus,SE)形成,探讨慢性癫痫发作后腹外侧中脑导水管周围灰质(the Ventrolateral Periaqueductal Gray,vl PAG)-脚桥核(Pedunculopontine Nucleus,PPN)通路神经传导的变化。方法:选取4~5周龄、体重80-110g的健康雄性成年Sprague-Dawley(SD)大鼠,随机分成A、B两组,再分别将A、B两组均随机分为对照组(Control)、匹罗卡品(Pilocarpine,Pilo)组、SE+Pilo组三组,每组6只大鼠。对A、B两组的SE+Pilo组予以腹腔注射匹罗卡品诱导癫痫持续状态(SE),Control组和Pilo组分别注射相同剂量的生理盐水。28天后运用脑立体定位仪向三组大鼠脑的脚桥核PPN区注射神经纤维逆向示踪剂荧光金(Fluoro Gold,FG),2天后分别对Pilo组和SE+Pilo组再次腹腔注射匹罗卡品诱导癫痫持续状态,Control组腹腔注射相同剂量的生理盐水,分别观察各组大鼠的癫痫发作状态和活动情况。1小时后,A组大鼠立即灌注固定取脑,然后应用免疫荧光技术对各组vl PAG区内c-Fos和囊泡谷氨酸转运体1(Vesicular Glutamate Transporter 1,v GLUT1)进行计数,对逆向示踪剂荧光金FG标记的c-Fos或v GLUT1进行计数以及FG的平均免疫荧光强度,分析vl PAG区内c-Fos和v GLUT1以及逆向示踪剂荧光金FG标记的c-Fos或v GLUT1的表达水平;B组大鼠应用热刺痛仪测试三组大鼠的热刺激撤足潜伏期(Paw Withdrawl Latency,PWL),观察三组大鼠的疼痛阈值是否升高或者降低。将荧光金FG注射到PPN中,通过在vl PAG中检测到荧光金FG,追踪从vl PAG到PPN通路的神经传导。采用FG免疫荧光强度和逆向示踪剂荧光金FG神经元数目评价vl PAG-PPN通路的神经传导活性。采用免疫组化方法计数各组c-Fos和v GLUT1以及FG标记的c-Fos或v GLUT1,分析癫痫发作和慢性癫痫发作后vl PAG-PPN通路兴奋性传导的变化。本研究中所有实验数据都采用均数±标准误(M±SEM)形式表示,运用单因素方差分析(One-Way ANOVA)统计分析三组免疫荧光染色数据和痛觉测试数据,运用LSD-t检验(Least-significant differencetest)分析每两组之间的差异,认为P0.05有统计学意义,P0.01有显著统计学意义。结果:A组:在Pilo组和SE+Pilo组两组大鼠的vl PAG神经元区域均能发现大量的荧光金FG,FG平均免疫荧光强度较Control组明显增高,差异有显著统计学意义(P0.01)。在vl PAG神经元中,与Pilo组相比,SE+Pilo组FG平均荧光强度明显降低,c-Fos和vGLUT1的阳性细胞计数明显减少,FG标记的c-Fos或v GLUT1计数也明显减少,但是显著高于Control组,差异有显著统计学意义(P0.01)。B组:SE+Pilo组热刺激撤足潜伏期时间较Pilo组明显缩短,但比Control组大鼠明显延长,具有统计学意义(P0.01)。结论:癫痫发作激活vl PAG-PPN通路的兴奋性传导,降低了疼痛敏感性,痛觉阈值升高;慢性癫痫发作后vl PAG-PPN通路的兴奋性传导弱化,增强了疼痛敏感性,痛觉阈值降低。因此,vl PAG-PPN通路兴奋性传导减弱与慢性癫痫有关,提示这种兴奋性传导参与了癫痫和偏头痛的共患病关系。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R742.1
【图文】：

实验设计,匹罗卡品,大鼠,癫痫持续状态

图 1 实验设计Fig 1 The experiment design2.2.2 腹腔注射匹罗卡品诱导癫痫持续状态对 A、B 两组大鼠分别进行标记并称重记录后，先对 Pilo组（30 天后）和SE+Pilo 组（30 天前和 30 天后）大鼠予以生理盐水新鲜配置的东莨菪碱溶液（1ml/kg）腹腔注射预处理，以拮抗匹罗卡品引起的外周胆碱能副作用，30min后，再对大鼠腹腔注射新鲜制备的匹罗卡品溶液（350mg/kg）诱导大鼠癫痫持续状态（Status Epilepticus, SE），观察大鼠的癫痫行为表现 ,判断 SE+Pilo 组大鼠是否形成癫痫持续状态。30 min 后，如果某些大鼠没有表现出痫性发作或发作状

桥核,红色,箭头,位置

安徽医科大学硕士学位论文谱指定的 PPN区域，以 0.1ul/min的速度缓慢注射 FG，每注射完 0.1ul后，微量注射器需静置 2min以使 FG 充分吸收，待注射完 0.5ul FG 后留针静置 10min再缓慢拔针，以防拔针过程中荧光金随针道溢出。使用相同的方法完成另一侧定位点的脑内注射。2.2.3.7 拔针后充分止血，用碘伏消毒手术区，用缝线间断缝合手术切口并再次用碘伏消毒，然后腹腔注射青霉素（1.2ml/kg），防止手术切口发生感染，待其麻醉苏醒后放入笼中进行常规饲养 48h。

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