Gordon Holmes综合征大鼠疾病模型构建及致病机制研究

发布时间：2020-06-25 22:13

【摘要】：背景遗传性共济失调是一类常见的神经遗传退行性疾病,以小脑性共济失调、小脑萎缩等为主要临床特征,虽经多年研究,但至今致病机制仍未研究清楚,同时治疗手段极为有限。临床病理及动物实验中发现,小脑中浦肯野细胞等的数量减少是遗传性共济失调的重要病理特征。为此研究遗传性共济失调的致病机制对于该类疾病的临床治疗具有重要意义。Gordon Holmes综合征是一种特殊类型的遗传性共济失调类疾病,临床表现为青少年起病的进行性小脑性共济失调同时合并有性腺发育不全,其遗传方式为常染色体隐性遗传。尽管临床上对于此疾病的认识已有100余年历史,但直到2013年5月,其第一种和第二种致病基因RNF216和OTUD4才被鉴定克隆。我们在2014年收集到了中国大陆首个Gordon Holmes综合征家系,同时应用全外显子测序发现了该病的第三种致病基因STUB1,其致病突变位点是T246M。STUB1具有泛素E3连接酶活性,同时可与Hsp70、Hsp90等分子伴侣相互作用,在蛋白质质量控制中起关键作用,STUB1功能障碍可导致体内蛋白的错误折叠和聚集。近年来研究表明,STUB1也可通过调节其他途径如坏死性凋亡等参与神经退行性疾病的致病机制。在其他种族人群中也有STUB1基因突变导致共济失调的报道,且TPR结构域和U-box结构域的突变均可导致疾病的发生。新的报道中临床表现更为复杂,锥体束损伤更为明显。这一现象提示我们STUB1基因突变不仅可以导致小脑神经元功能障碍,还可以影响运动神经元的功能,但具体机制仍不清楚。为了深入研究STUB1导致Gordon Holmes综合征的致病机制并提供合适的动物模型,我们应用CRISPR/Cas9技术构建了STUB1基因T246M突变的转基因大鼠。该疾病模型表现体重减轻,寿命缩短,运动协调性下降,平衡能力受损,同时病理上表现为浦肯野细胞死亡。随后,我们应用差异蛋白质组学技术研究了STUB1突变大鼠小脑组织中差异表达的蛋白质以进一步探讨其致病机制。共鉴定出143种差异表达蛋白,其中表达上调蛋白80种,表达下调蛋白63种。这些差异表达蛋白生物功能主要涉及分子结合、催化反应活性、转运体功能、核酸结合转录因子活性、蛋白结合转录因子活性、酶活性调节、受体活性、电荷转运体活性等方面;蛋白位置分布涉及细胞浆、细胞器、细胞膜、大分子复合物、细胞外区域等方面;生物过程主要有细胞过程、单细胞有机体过程、代谢过程、刺激反应过程、生物调节过程、多细胞有机体过程、信号传导过程、发育过程方面。KEGG Pathway分析表明差异表达蛋白主要集中于免疫、内分泌、代谢等方面。同时结合当前研究,我们认为差异表达蛋白中PDE9A、tau、PHLPP1、α-syn等可能参与致病。这种新型的大鼠模型忠实地模拟了人类Gordon Holmes综合征疾病的临床表型,并将用于深入研究STUB1相关神经退行性疾病的致病机制。蛋白质组学结果为进一步的机制及潜在治疗策略研究提供了思路和依据。目的1.构建STUB1基因点突变Gordon Holmes综合征大鼠疾病模型。2.通过检测大鼠疾病模型的行为学、STUB1蛋白表达量的变化以及疾病模型小脑等组织的病理学特征和生殖能力,分析STUB1基因点突变Gordon Holmes综合征大鼠疾病模型能否较好的模拟该病的临床表型。3.应用差异蛋白质组学技术研究Gordon Holmes综合征可能的致病机制,为深入研究及探索治疗策略提供依据。方法1.应用Cas9/sgRNA技术及显微注射技术构建STUB1基因定点突变大鼠,并进行基因型鉴定。2.应用转轮实验、Catwalk步态分析、水迷宫等分析大鼠行为学;应用western blot、免疫化学染色等分析大鼠STUB1基因表达及浦肯野细胞数量;应用放射免疫分析大鼠性激素水平。3.应用差异蛋白质组学技术及生物信息分析技术对纯合型大鼠蛋白表达进行分析,并选择可能与致病机制相关的通路或蛋白。结果1.STUB1基因点突变Gordon Holmes综合征大鼠疾病模型构建成功。经过鼠尾提取DNA进行PCR扩增及Sanger测序,获得了具有稳定基因型的子代大鼠。2.在行为学实验中,从第12周开始,纯合型大鼠转轮实验掉落潜伏期明显缩短(P0.05);从第16周开始步态分析也表现出统计学差异(P0.05)。从发病早期开始,纯合型大鼠即表现出学习记忆功能的减低(P0.05)。此外,从第8周起,纯合型大鼠体重减低(P0.05);生存时间缩短(P0.05)。以上各指标中,杂合型与野生型相比无明显差异。3.经western blot检测,纯合型大鼠大脑、小脑、睾丸中STUB1蛋白表达水平减低(P0.05),且高周龄减低更为明显,免疫组化结果与之一致。经免疫荧光检测,纯合型大鼠小脑中浦肯野细胞数量减少(P0.05)。同时,纯合型大鼠的海马组织可见细胞形态明显异常及排列紊乱。4.大鼠血清水平测定结果显示:纯合型STUB1点突变大鼠雌二醇水平减低(P0.05),卵泡刺激素、黄体生成素含量增高(P0.05),野生型与杂合型无明显区别。5.经与野生型比较分析,共得出纯合型大鼠疾病模型差异表达蛋白143个,其中上调蛋白80个,下调蛋白63个,蛋白表达存在差异。6.通过对STUB1点突变动物模型差异表达蛋白GO注释和KEGG pathway分析,其生物功能主要涉及分子结合、催化反应活性、转运体功能、核酸结合转录因子活性、蛋白结合转录因子活性、酶活性调节、受体活性、电荷转运体活性等12个方面,差异表达蛋白位置分布涉及细胞浆、细胞器、细胞膜、大分子复合物、细胞外区域等16个方面,差异表达蛋白参与的生物过程有细胞过程、单细胞有机体过程、代谢过程、刺激反应过程、生物调节过程、多细胞有机体过程、信号传导过程、发育过程等23个方面。KEGG pathway则表明差异蛋白主要集中于免疫、内分泌、代谢等方面。7.在上述分析结果的基础上结合查阅文献筛选得到了一些可能与Gordon Holmes综合征致病机制有关的蛋白如PDE9A、tau、PHLPP1、α-syn等,并对其进行了初步验证。结论1.通过应用CRISPR/Cas9技术,STUB1基因点突变大鼠Gordon Holmes综合征疾病模型构建成功。2.与野生型与杂合型相比,纯合型STUB1点突变大鼠疾病模型行为学检测指标显示其平衡及运动协调能力均明显减低,学习记忆功能也明显减低。STUB1基因的表达在纯合型大鼠明显减低,且进行性减少;组织病理学特征显示小脑浦肯野细胞明显减少;且表现出生殖能力低下的表型,表明Gordon Holmes综合征大鼠疾病模型很好地模拟了人类疾病临床表型,为深入研究致病机制及治疗策略打下了基础。3.通过蛋白质组学及生物信息分析可知STUB1点突变大鼠与野生型大鼠的蛋白表达存在很大差异,并得出了一系列可能的致病通路及蛋白,以上分析结果为进一步研究Gordon Holmes综合征和其他CHIP相关疾病的致病机制以及探索治疗策略提供了新思路新靶点。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R744.7
【图文】：

示意图,示意图,鼠尾,裂解液

图 1.1 打靶载体示意图STUB1 基因敲入的打靶载体主要包括以下功能元件：点突变位点：exon6（p.T247M）； 5’端和 3’端的同源臂均约为 2kb；1.1.4.2 靶序列的测序确认1.1.4.2.1 SD 大鼠鼠尾 DNA 提取1）剪取拟进行实验的大鼠尾尖部 0.3-0.5cm；2）配制 1×裂解液，裂解配制方法为单个样品中 4μl Proteinase K，200μl 1×Mouse tissue Lysis Buffer，将二者涡旋震荡，充分混匀后方可使用；3）将鼠尾放于 1.5ml EP 管中，添加 200μl 1×裂解液浸没鼠尾样本，涡旋震荡后 55℃水浴中孵育 30min；4）待孵育完成后，将样品置于 100℃干浴锅中加热 5min 灭活 Proteinase K；

基因型鉴定,引物设计,策略

图 1.2 基因型鉴定引物设计策略2）大鼠标记仔鼠出生 7 天左右，剪去不同脚趾的末节，通过不同脚趾的缺失排布以确定该鼠的编号。此法不需麻醉，只截去趾的末节以防指甲重长。符号说明：前肢用字母 F（front leg）表示，后肢用字母 R（rear leg）表示；3）鼠尾 DNA 提取及 PCR 扩增鼠尾 DNA 提取步骤见 1.1.4.2.1，PCR 反应体系同表 1-14）PCR 反应条件见表 1.11表 1.11 子代大鼠基因型鉴定 PCR 反应条件温度时间94℃ 5min94℃ 30s67℃ 30s (-0.7℃/s) 15cycles68℃ 1kb/min94℃ 30s

【参考文献】