TLR4拮抗剂对脑出血小鼠的神经保护作用

发布时间：2020-06-27 01:23

【摘要】：背景与目的脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是指非外伤性脑实质出血,在我国约占全部脑卒中的20%-30%,发病1月内的病死率可高达40%,且存活者多遗留有明显的神经功能障碍,给患者家庭及社会带来了沉重的负担,严重的危害人类健康。目前对脑出血的治疗尚缺乏有效的手段,因此深入研究脑出血的发病机制、寻找脑出血有效的治疗靶点至关重要。炎症反应在脑出血二次损伤过程中具有重要作用,小胶质细胞与浸润至血肿周围的巨噬细胞等表面的Toll样受体家族可能对脑出血相关炎症反应具有重要的调控作用,可能会成为脑出血治疗的潜在靶点。因此本课题拟通过给予外源性TLR4(Toll-like receptor 4,Toll样受体4)拮抗剂研究拮抗TLR4的作用对脑出血小鼠相关炎症反应、脑损伤程度与神经功能的影响,论证能否通过调控TLR4相关的炎症反应达到治疗脑出血的目的,为脑出血的治疗研究提供更多基础理论支持。方法1实验动物与分组:无特定病原体(SPF)级C57BL/6雄性小鼠,8-10月龄,体质量30-35g,共128只,按照随机数字表分为4组:(1)假手术+溶剂对照组(sham+vehicle,n=32),术前于相同时间腹腔注射等量无菌生理盐水;(2)假手术+TAK-242组(sham+TAK-242,n=32),术前腹腔注射TAK-242;(3)脑出血+溶剂对照组(ICH+vehicle,n=32),术前腹腔注射等量生理盐水,术中向纹状体注射0.5ul含有0.075U的VII型胶原酶;(4)脑出血+TAK-242组(ICH+TAK-242,n=32),术前腹腔注射TAK-242。2小鼠脑出血模型的制作:采用立体定位注射法向左侧尾状核注射0.075U VII型胶原酶,尾状核定位为:前囟前0.6mm,向左2.0mm,进针深度3.2mm。术后神经功能缺损评分4分为模型失败,排除实验。假手术组与脑出血组操作相同,但微量注射器只进针不注胶原酶。3TLR4拮抗剂的配制与使用:将10mg TAK-242粉末溶于1ml DMSO(二甲基亚砜)配成母液并分装保存于-80℃冰箱,用前用无菌生理盐水稀释至1ug/ul,于术前一周隔天腹腔注射一次,共三次,剂量为3mg/Kg体重。溶剂对照组在相同时间点腹腔注射等体积无菌生理盐水。4实验观察指标:(1)急性期脑部组织形态指标:Luxol Fast Blue/Cresyl Viol et、FJB染色分别检测脑出血3天血肿体积大小、神经元变性程度(n=8/group)。(2)分子生物学指标:脑出血术后第1、3、7、14天用ELISA试剂盒检测血清中IL-10、IL-23浓度。(3)远期脑组织形态与行为学评价:Luxol Fast Blue/Cr esyl Violet染色检测脑出血后28天脑组织残余病灶、脑萎缩程度、脑白质损伤程度,行为学检测脑出血第1、3、7、14、28天检测神经功能评分(NDS)、前肢放置实验、转角实验以评价神经功能,并在此过程中记录各组小鼠肛温及存活情况。5统计学方法:使用SPSS21.0、Graphpad Prism5软件进行统计分析,定量资料用均数±标准差(?x±s)表示,用t检验进行两组间差异性比较,用单因素方差分析、非参数检验进行多组间差异性比较,然后用Bonferroni或Dunn’s进行多重两两比较。两组间小鼠死亡率的比较用χ~2检验进行。P0.05为差异有统计学意义。结果1 TLR4拮抗剂干预显著减轻了ICH急性期的脑损伤程度。溶剂对照组与TLR4拮抗剂干预组在脑出血3天均有脑组织损伤和FJB阳性细胞,但与溶剂对照组相比,TLR4拮抗剂干预组脑出血3d的血肿体积较小、FJB阳性细胞数较少,差异有统计学意义(n=8/group,P=0.015)。2 TLR4拮抗剂显著减轻脑出血小鼠远期脑损伤程度并促进远期神经功能恢复。溶剂对照组与TLR4干预组在脑出血28天时均有不同程度的脑萎缩、脑白质损伤及大小不同的残余病灶,但与溶剂对照组相比,TLR4拮抗剂干预组在脑出血后28天残余病灶较小(n=8/group,P=0.012)、脑白质损伤程度较轻(n=8/group,P=0.012)、脑萎缩程度低于前者(n=8/group,P0.001),差异均有统计学意义。各组小鼠在脑出血后均有不同程度的神经功能缺损。与溶剂对照组相比,从脑出血后第1~28天,TLR4拮抗剂干预组NDS评分低、右前肢放置百分比高、左转率低,差异有统计学意义(术后第1~28天,4组间NDS评分的H值分别为50.18、49.93、50.82、52.89、58.77,P值均0.001,n=12-14/group;4组间前肢放置百分比H值分别为54.28、22.85、26.16、26.16、41.04,n=12-14/group,P值均0.001;4组间转角实验的Kruskal-Wallis检验统计值H分别为:47.26、44.35、39.66、40.35,n=12-14/group,P值均0.001)。3TLR4拮抗剂对脑出血后炎症因子的影响。与溶剂对照组相比,TLR4拮抗剂可上调脑出血后早期血清中IL-10含量,在第1、3、7天差异均有统计学意义(4组间差异性比较的F值分别为9.229、18.039、5.657,P值分别为0.001、0.001、0.008,n=5/group),但在第14天差异无统计学意义(F=-4.882,P=0.633,n=5/group)。TLR4拮抗剂干预组血清IL-23含量稍高,但与溶剂对照组相比,仅第7天差异有统计学意义(第1、3、7、14天多组间差异性比较的H值分别为1.743、0.141、9.629、2.229,P值分别为0.627、0.987、0.022、0.526,n=5/group)。结论1 TLR4拮抗剂能够显著减轻小鼠脑出血急性期与远期的脑损伤程度,并具有促进远期神经功能恢复的作用。2 TLR4拮抗剂能够影响脑出血小鼠外周血中炎症因子的表达,其神经保护作用的机制可能与对脑出血相关炎症反应的调节有关。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R743.34
【图文】：

肛温,小鼠,拮抗剂,死亡率

结果.1 动物死亡率及肛温比较.1.1 动物死亡率sham+vehicle 组及 sham+TAK-242 组小鼠无死亡，ICH+vehicle 组小鼠只，ICH+ TAK-242 组小鼠死 3 只，死亡原因为模型损伤及麻醉过量。溶组（12.5%，4/32）与 TAK-242 干预组小鼠死亡率（9.4%，3/32）相比较无统计学意义（χ2=0.0，P＞0.05）。.1.2 TLR4 拮抗剂对脑出血小鼠肛温的影响量取并记录小鼠术前、术后 1、3、7、14、28 天的肛温。

曲线,脑出血急性期,脑损伤,拮抗剂

图 2.2 TLR4 拮抗剂减轻脑出血急性期脑损伤体积A 图为脑出血 3 天脑组织 50um 切片的 Luxol Fast Blue/Cresyl Violet 染色，用于检测脑损伤体积。其中 a、b、c、d 图分别为 sham+vehicle 组、sham+TAK-242组、ICH+vehicle 组、ICH+TAK-242 组，未被染色、黑色曲线圈中部分为脑损伤，图中标尺为 500um。sham+vehicle 与 sham+TAK-242 组脑组织完整，Luxol FastBlue/Cresyl Violet 染色均匀；ICH+ vehicle 与 ICH+TAK-242 组均有脑组织损伤，但 TLR4 拮抗剂干预组脑损伤体积明显小于溶剂对照组，即 TLR4 拮抗剂能够显著减轻脑出血 3d 的血肿体积。ICH+vehicle 与 ICH+TAK-242 组脑出血 3 天脑损伤体积的统计结果用箱线图表示（箱线图中间的水平线代表中位数，箱线图外上下两条线分别代表最大值与最小值），用 Mann-Whitney U 检验进行两组间差异性比较（B），与溶剂对照组相比，TLR4 拮抗剂干预组的脑出血 3 天血肿体积较小，差异有统计学意义（scale bar=500um, n=8/group, U=4.0, P=0.015＜0.05，“*”表示与 ICH+vehicle 组相比，差异有统计学意义）。

【相似文献】