白介素受体相关激酶M基因敲除对缺血性脑卒中的影响的研究

发布时间：2020-07-01 01:53

【摘要】：背景缺血性脑卒中涉及多种病理生理学机制,研究证据表明炎症反应是缺血性脑损伤的重要发病机制之一,并且可能为中风治疗提供靶点。白介素1受体相关激酶M(IRAK-M)负调节Toll样受体(TLRs)信号通路,通过对固有免疫反应的信号重编程负反馈抑制炎症反应。它在多种感染与疾病的病理生理学过程中至关重要,但IRAK-M在脑缺血再灌注中的作用尚不清楚。目的本研究拟探讨白介素1受体相关激酶M在小鼠大脑中动脉阻塞术后脑损伤中的作用。方法本研究使用大脑中动脉阻塞法(middle cerebral artery occlusion)MCAO诱导C57BL/6小鼠缺血性脑卒中模型,并使用激光多普勒检测小鼠术中和术后的脑血流变化。1)qPCR检测脑缺血再灌注后分别1小时,8小时,12小时,24小时测脑梗区IRAK-M的mRNA的表达;2)检测抑制HIF-1α的表达后IRAK-M的表达情况;3)分别在野生型(WT)、敲除(KO)小鼠上制备MCAO模型,再灌注24小时后比较两组动物神经功能评分和梗死体积的影响。4)干湿重法评估IRAK-M基因敲除后对小鼠术后脑水肿的影响;5)伊文氏蓝(Evans Blue)和免疫组化标记IgG检测两组小鼠术后血脑屏障(blood brain barrier,BBB)的损伤;6)利用定量PCR、蛋白印迹法检测脑缺血再灌注后两组小鼠之间基质金属酶和炎症因子mRNA和蛋白表达情况。结果1.IRAK-M在脑缺血再灌注后表达升高:(1)脑缺血再灌注损伤后IRAK-M表达上调qPCR结果显示在小鼠脑缺血再灌注后1小时IRAK-M的mRNA表达量升高并且达到最高峰,并且在之后的24小时内逐渐降低;(2)脑缺血再灌后1小时注HIF-1α的表达上调与IRAK-M的表达升高相关在MCAO造模之前腹腔注射HIF-1α的抑制剂2ME2后使用qPCR检测IRAK-M的表达下调;2.IRAK-M基因敲除加重小鼠缺血性脑卒中的脑血管组织是损伤的程度:(1)IRAK-M基因敲除加重缺血性脑卒中的神经功能评分。与WT小鼠相比,IRAK-M KO小鼠的Bederson评分升高,grip test的评分降低,表现为更严重的神经功能损伤;(2)与WT小鼠相比,IRAK-M KO鼠和缺血性脑卒中体积和脑水肿体积增加。IRAK-M KO小鼠的缺血性脑卒中体积和水肿百分比较WT小鼠明显增加;(3)IRAK-M KO鼠较WT小鼠相比有更高的含水量和更高的出血转化发生率。IRAK-MKO鼠在肉眼和数据上均表现较高的脑水肿。IRAK-MKO的出血转化的发生率明显高于对照组;(4)与WT小鼠相比IRAK-MKO鼠有更严重的血脑屏障的破坏。IRAK-MKO鼠脑组织中有更多的伊文斯蓝的渗出。冰冻切片IgG染色发现KO小鼠脑组织中IgG的染色深度和体积也明显增加。3.IRAK-M基因敲除小鼠缺血性脑卒中侧的基质金属蛋白酶和炎症因子表达升高:(1)血脑屏障破坏相关因子基质金属蛋白酶在IRAK-MKO鼠表达升高。IRAK-M基因敲除后缺血性脑卒中后的4小时和24小时有不同程度的MMP-2和MMP-9的表达上调,可能与血脑屏障破坏加重有关。(2)IRAK-M基因敲除导致小鼠脑梗死侧脑组织中炎症因子的表达上调。IRAK-MKO小鼠梗死侧IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10、iNOS、COX-2 以及NLRP3等炎症因子表达较WT小鼠明显升高。(3)IRAK-M基因敲除增强NF-κB信号通路的激活。IRAK-M KO鼠梗死侧的细胞核内的P65的蛋白量检测发现其表达量明显高WT鼠梗死侧。结论1.IRAK-M在小鼠脑缺血再灌注的过程中表达增高,并且IRAK-M的表达增高可以被HIF-1抑制剂2ME2抑制。2.IRAK-M基因敲除通过加重炎症而增加缺血性脑卒中的体积、加重缺血性脑卒中后的脑水肿和血脑屏障的破坏。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R743.3
【图文】：

激光多普勒,脑缺血再灌注,赋形,脑血管

丨ＲＡＫ－Ｍ表达的诱导。为了研究ＨＩＦ－ｌａ是否是缺血再灌注后诱导丨ＲＡＫ－Ｍ上调逡逑的诱因，我们在ＭＣＡＯ手术前抑制ｍＦ－ｌａｍＲＮＡ的表达。结p}显示，与赋形逡逑剂组相比，２ＭＥ２显著抑制脑缺血后１小时的ＨＩＦ－ｌａ以及丨ＲＡＫ－Ｍ表达（图２－２），逡逑表明增加ＨＩＦ－ｌａ可能与脑血管阻塞和再灌注后ＩＲＡＫ－Ｍ的上调有关。逡逑１３逡逑

激光多普勒,脑缺血再灌注,基础水平,标准差

妒、０邋Ｐ逦）逡逑图２－１．脑缺血再灌注之后ＩＲＡＫ－Ｍ表达明显增高．（Ａ）激光多普勒检测ＭＣＡＯ对小鼠脑血逡逑流（ＣＢＦ）的影响，以与基础水平的百分比表示。（Ｂ＞采用实时ＲＴ－ＰＣＲ检测梗死脑半球再灌逡逑注后不同时间点ＩＲＡＫ－Ｍ的相对ｍＲＮＡ水平。所有实验数据以均数±标准差表示，每组ｎ＝６，逡逑与假手术组相比，＊尸＜０．０５，ＭＰＣＯ．Ｏｌ。逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１邋ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ邋ｋｉｎａｓｅ邋（ＩＲＡＫ）－Ｍ邋ｗａｓ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ邋ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ逡逑ａｆｔｅｒ邋ｃｅｒｅｂｒａｌ邋ｉｓｃｈｅｍｉａ邋ｒｃｐｅｒｆｕｓｉｏｎ．邋（Ａ）邋Ｃｅｒｅｂｒａｌ邋ｂｌｏｏｄ邋Ｈｏｗ邋（ＣＥＢＦ）邋ｏｆ邋ｍｉｃｅ邋ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ邋ｔｏ逡逑ｔＭＣＡＯ邋ｄｅｔｅｃｔｅｄ邋ｂｙ邋ｌａｓｅｒ－Ｄｏｐｐｌｅｒ邋ａｎｄ邋ｓｈｏｗｅｄ邋ａｓ邋ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ邋ｏｆ邋ｂａｓａｌ邋ｌｅｖｅｌ．邋（Ｂ）邋Ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｍＲＮＡ逡逑ｌｅｖｅｌｓ邋ｏｆ邋ＩＲＡＫ－Ｍ邋ｗｅｒｅ邋ｍｅａｓｕｒｅｄ邋ｂｙ邋ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ＲＴ－ＰＣＲ邋ａｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｉｍｅ邋ｐｏｉｎｔｓ邋ａｆｔｅｒ邋ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ逡逑ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｉｎｆａｒｃｔｅｄ邋ｃｅｒｅｂｒａｌ邋ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｅ．邋Ｄａｔａ邋ａｒｅ邋ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ邋ａｓ邋ｍｅａｎ邋土邋ＳＤ

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