MicroRNA-155在癫痫发病中的作用及机制研究

发布时间：2020-07-02 06:36

【摘要】：目的:MicroRNA-155(miR-155)在免疫和炎症过程中起着重要作用,但目前尚不清楚miR-155介导的炎症是否参与了癫痫的发生,本论文通过海人酸(KA)诱导的癫痫动物和细胞模型,来研究miR-155在癫痫疾病过程中的作用,并进一步在癫痫患者的血液中来验证动物模型的结果,希望探索新的生物标志物来解决临床问题。方法:采用KA腹腔注射的C57BL/6小鼠癫痫模型和KA处理的原代细胞癫痫模型,运用脑电图监测、侧脑室立体定位、提取蛋白质和RNA、实时荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹、原代细胞培养、Fluoro-Jade B(FJB)染色等大量实验来研究miR-155的表达水平、分布、靶基因等,并在癫痫患者的血液中,提取miRNA,通过实时荧光定量PCR来验证miR-155的表达。结果:在成功的癫痫小鼠模型中,miR-155在癫痫小鼠海马中的表达较对照组(Ctrl组)显著升高,脑电图显示实验组(KA组)小鼠出现的癫痫波改变明显,侧脑室注射miR-155拮抗剂(miR-155 antagomir)后,我们发现KA+ antagomir组脑电图的癫痫波出现频率和幅度较KA组降低,在FJB染色中,KA组较对照组CA2区神经元变性数量多,KA+ antagomir组神经元变性坏死数目减少;在成功的癫痫细胞模型中,miR-155在胶质细胞中的表达比在神经元中的高,在小胶质细胞中,用50μM的KA处理的时间梯度中,miR-155的表达显著上调,且通过多个预测靶基因进行实验性验证,发现Csflr随着时间梯度变化显著下调,KA+antagomir组Csflr蛋白表达水平较Ctrl组上调;在癫痫患者血液中,与健康对照组相比,miR-155表达水平显著升高。结论:MiR-155通过诱导小胶质细胞参与炎症促进癫痫的发生,靶基因为Csflr;应用miR-155 antagomir可减轻癫痫发作、改善脑电图放电现象、减少神经元受损;血液中miR-155水平可能是癫痫潜在的生物标志物,而抑制小胶质细胞中miR-155的表达可能是癫痫的治疗策略。
【学位授予单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R742.1
【图文】：

溶解曲线,小鼠模型,癫痫,海马

笫三章实验结果与分析逡逑第三章实验结果与分析逡逑３．１邋ｍｉＲ－１５５水平在ＫＡ诱导的癞痫发作小鼠中升高逡逑将海人酸按１５ｍｇ／ｋｇ的剂量给实验小鼠腹腔注射，对照组则相同剂量腹腔注逡逑射生理盐水，癫痫发作后按Ｒａｃｉｎｅ分级选择实验需要的小鼠（癫痫小鼠３只，逡逑对照小鼠３只），２４小时后心脏灌流，取小鼠的海马和皮层，提取ＲＮＡ，通过实逡逑时定量ＰＣＲ邋（邋ｑＲＴ－ＰＣＲ邋）来检测处理后的小鼠的大脑中的逡逑ｍｉＲ－１５５／ｍｉＲ－２００ｂ／ｍｉＲ－２３ａ的表达水平。内参基因为Ｕ６，实验中的ｍｉＲＮＡ扩增逡逑曲线平滑，溶解曲线仅有一个溶解峰，结果显示，与对照组相比，ＫＡ处理后皮逡逑层和海马中ｍｉＲ－１５５的水平显着升高，差异具有统计学意义。逡逑ＡＢ逡逑

神经,靶基因

脑中不同神经细胞类型中的表达情况，我们用５０＾Ｍ浓度的ＫＡ处理细胞后，逡逑用ｑＲＴ－ＰＣＲ方法来验证表达，实验中我们发现ｍｉＲ－１５５在小胶质细胞和星形胶逡逑质细胞中的表达比在神经元中丰富（图３．４Ａ）。此外，在富含ｍｉＲ－１５５的小胶逡逑质细胞中，观察随着时间梯度中ｍｉＲ－１５５的表达情况（图３．４Ｂ），以此发现相关逡逑性来预测靶基因，ｍｉＲ－１５５表达随着时间推移升高。有文献显示［５°］，ｍｉＲ－１５５靶逡逑基因可能为Ｃｓｆｌｒ、Ｔｌｒ６、Ｃ８ｏｒｆ４、Ｐｅａｌ５ａ等，我们用ｑＲＴ－ＰＣＲ技术对这些预测逡逑靶基因进行实验性验证，观察ｍＲＮＡ水平的变化，因为ｍｉＲＮＡ对于靶基因的调逡逑控均是负向调控，所以随着时间关系，靶基因的表达是下调的，在筛选的多个预逡逑测靶基因中，我们猜测Ｃｓｆｌｒ可能为ｍｉＲ－１５５的靶基因（图３．４Ｃ）。逡逑己用ｑＲＴ－ＰＣＲ方法验证Ｃｓｆｌｒ为ｍｉＲ－１５５的靶基因，接着通过细胞转染、逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ技术检测Ｃｓｆｌｒ蛋白水平变化（图３．５Ａ、Ｂ）。逡逑３４逡逑

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