基于生物信息学分析高表达GALNT7和MRC2对胶质瘤细胞增殖、侵袭性的影响

发布时间：2020-07-02 14:22

【摘要】：胶质瘤作为中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,不仅发病率日趋增高,且患者预后极差,以美国脑肿瘤中心统计结果为例,胶质瘤经过系统治疗后5年以内的生存率仅为10～20%。根据胶质瘤细胞的分化特征和组织病理学特征,WHO中枢神经系统肿瘤分型有4个级别,Ⅰ级胶质瘤患者的预后较好。Ⅱ级胶质瘤预后不良,但可以存活很长时间。而Ⅲ级,如星形细胞瘤,又或Ⅳ级的胶质母细胞瘤,均具有分化程度低,高度侵袭且极易复发,故归为高级别胶质瘤。除了上述临床已广泛应用的分类方法,根据分子病理学特征能更精确对胶质瘤细胞的生物功能进行分类。目前胶质瘤的分子病理分型方法主要有美国TCGA胶质瘤四分类法和中国CGGA,其中CpG岛甲基化(CpG island methylation)、EGFRvⅢ扩增(EGFRvⅢamplification)、MGMT启动子甲基化(MGMT promotor methylation)、PTEN突变(PTEN mutation)、TP53突变(TP53 mutation)、BRAF融合和突变(BRAF fusion and mutation)等分子指标已用于临床检测,这些肿瘤的特征性标志物虽然可以指导治疗并预测疗效,但其影响生物表型机制的研究呈碎片化,未能构建完整的交通网络,为了解决这一问题,以高通量微阵列芯片测序技术为代表的第二代测序技术应运而生,改变了以往针对DNA分子测序不及时不全面的问题,单次既可完成数百万条序列的完整测定,由此产生了海量的生物信息学数据成为人类基因组计划启动的原始基础。与此同时,通过交叉利用遗传学、分子生物学、数学、统计学以及计算机编程等多门学科的技术,针对海量的数据进行分类整理,最终发展出生物信息学(Bioinformatics),并建立了包括TCGA、KEGG等多个数据库,用于肿瘤分析标志物的筛查,深度解析肿瘤细胞生物学功能的作用机制,服务于全球科研工作者。TCGA数据库由美国国家卫生研究院发起的公共资助项目,是全世界最大规模的基因工程成果,旨在通过大规模基因组测序和多维分析,对人类肿瘤群体的主要致癌基因进行研究和分类,并免费向全球肿瘤研究人员提供不同级别数据,从经过处理的Level 3数据(如处理过的基因甲基化的β数据),到Level 1未处理的原始数据集(如450K甲基化芯片原始数据),均可通过官方工具或R软件、perl软件等不同方式下载;除了涵盖mRNA、lncRNA、miRNA以及甲基化等不同类型的表达数据之外,TCGA数据库还针对每一种疾病、每一个样本进行了严格的随访,并整理成完整数据集以供查阅。通过综合分析TCGA内表达数据和临床数据,可为研究者在筛选研究目标基因、进行对照分析、验证实验结果等不同领域提供详实可靠的数据。KEGG数据库由日本京都大学生物信息中心建立并管理,此数据库主要涉及基因组破译方面研究,结合基因组学、生物化学、生物信息学等方面的研究,把已经完成测序的基因序列与细胞的生物学功能进行系统关联,建立起人类基因表达调控的完整网络。整个KEGG数据库内包含十几个不同的子数据库,子数据库间内容相互关联印证,不但包含了几乎所有的信号通路的信息,还将信号通路与所含的每一个基因、调控的功能和涉及的疾病集中整合,以图文并茂的形式展现给研究者,是研究信号通路相关信息中最为重要的数据库。本研究中,通过这TCGA、KEGG和GTEx等多个数据库内胶质瘤的相关信息进行进行生物信息学分析,对特异性表达基因进行大规模筛查,并深入研究影响基因表达的机制,构建跨基因、跨通路的表达调控网络,深度解析潜在的抑癌、促癌基因影响胶质瘤生物学功能的机制,尤其是特定基因或基因集的表达变化对信号通路状态或生物表型的影响研究。目的:1.基于生物信息学方法对胶质瘤中特异性生物标志物进行大规模筛查,探索生物信息学在胶质瘤生物功能分析中的应用。2.探讨GALNT7在胶质瘤中的差异性表达及其对胶质瘤细胞生物学功能的影响;3.探讨胶质瘤中MRC2甲基化水平对表达的影响,分析MRC2甲基化水平和mRNA表达间的调控关系,预测两者对胶质瘤细胞生物学功能的影响。方法:1.基于R X64 3.4.1软件下载TCGA数据库内胶质瘤相关mRNA和Clinical数据,通过基因差异性表达分析初步筛选出在胶质瘤中呈差异性表达的目标基因:多肽n-乙酰半乳糖基转移酶7(polypeptide N-acetyl galactosaminyl transferase 7,GALNT7)和甘露糖受体C2(mannose receptor C type 2,MRC2)。2.对GALNT7和MRC2 mRNA表达量进行单因素方差分析和多重比较,检验GALNT7和MRC2在不同级别胶质瘤和正常脑组织内表达的差异性。3.以TCGA数据库内GALNT7和MRC2在胶质瘤组织内的表达量中位值为标准,将GALNT7和MRC2在胶质瘤内的表达量分为高、低表达组,通过t检验分析GALNT7MRC2 mRNA表达量的变化与临床特征的相关性,同时采用Kaplan-Meier生存分析探讨GALNT7和MRC2表达量的变化对无瘤生存期(Disease-Free Survival,DFS)和总体生存期(Overall Survival)间的影响。4.以TCGA数据库内GALNT7和MRC2表达的中位值为标准,将胶质瘤内GALNT7和MRC2 mRNA表达量的数据分为高、低表达组。从分子特征数据库(Molecular Signatures Database,MsigDB)下载参考集2.cp.kegg.v5.1.symbols.gmt,根据缺省加权富集法,随机组合的数量定为1000次,名义P值(Nominal P-values,NOMP)0.05,错误发现率(False Discovery Rates,FDR)0.25。结合KEGG数据库内信号通路的资料,使用GSEA3.0软件进行基因富集分析。根据富集分析结果,探讨GALNT7和MRC2高表达状态所激活的信号通路对胶质瘤细胞生物学功能的影响,进而深度解析GALNT7和MRC2差异性表达对胶质瘤预后的影响机制。5.联合分析TCGA 数据库内GBM和LGG的Illumina Human Methylation 450 BeaChip数据和mRNA Counts数据,分析基因甲基化和表达之间的关系,最终确定以MRC2甲基化及其启动子(Promoter)区域和第一内含子(First intron,Intron 1)区域内位点甲基化作为研究目标,并结合TCGA内GBM和LGG的Clinical数据,整体分析MRC2甲基化和位点甲基化水平对mRNA表达和生存期的影响。6.通过临床手术收集样本,包括胶质瘤Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级肿瘤组织以及正常脑组织,同时培养胶质瘤细胞株U373和A172。所有临床样本经HE染色后,在电镜下根据病理学特征进行分级;以正常脑组织作为对照组,行免疫组化实验和Western Blot实验,观察GALNT7和MRC2在正常脑组织、不同级别胶质瘤和胶质瘤细胞株中表达的情况。结果:1.通过差异性表达分析TCGA内胶质瘤mRNA表达数据,发现GALNT7和MRC2在胶质瘤中均呈高表达,且表达量在GBM中表达最高,LGG中次之,正常脑组织中最少(P0.05);临床相关性分析提示性别对GALNT7表达水平无影响(P=0.82),年龄、肿瘤分级均影响其表达,且和生存状态相关(P0.05);MRC2表达水平与性别无关(P=0.516),但与年龄、肿瘤分级和生存状态有关(P0.05);GALNT7和MRC2高表达的胶质瘤患者的DFS和OS 比低表达的胶质瘤患者缩短(P0.05)。2.针对GALNT7的基因集富集和皮尔森系数(r)进行基因相关分析表明,高表达的GALNT7可能通过与5个共表达基因共同调节5条信号通路,进而影响胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力,其中影响增殖的基因和信号通路包括:RAC1调节的NK细胞介导的细胞毒性信号通路、PVR调节的CAMs信号通路、TNC调节的ECM-receptor interaction作用信号通路;影响侵袭的基因和信号通路包括:Crk调节的肌动蛋白细胞骨架信号通路和STAT3调节的JAK-STAT信号通路。差异分析显示Crk、RAC1、STAT3和TNC表达与胶质瘤的恶性程度呈正相关。PVR在GBM中高表达,而在LGG中表达低于正常脑组织(P0.05)(图6)。生存分析显示,RAC1、STAT3、PVR和TNC的表达与无瘤生存期(Disease-Free Survival,DFS)呈负相关,而与Crk的表达无明显相关性。Crk、RAC1、STAT3、PVR、TNC的表达水平与总生存期(Overall Survival,OS)呈负相关(P0.05)3.针对MRC2的基因集富集和皮尔森系数(r)进行基因相关分析表明,高表达MRC2可通过7个共表达基因激活7条重要的信号通路,进而影响胶质瘤细胞的增殖和侵袭。其中影响增殖的途径包括:NOTCH3参与调节的NOTCH信号通路,MYD88参与调节的TLRs信号通路,HLA-A参与调节的NK细胞介导的细胞毒性信号通路和STAT3参与调节的JAK-STAT信号通路;影响侵袭的途径包括MSN激活的肌动蛋白细胞骨架信号通路,CD276参与的CAMs信号通路以及TNC调节的ECM-receptor interaction信号通路。差异分析显示NOTCH3、MYD88、MSN、HLA-A、STAT3、CD276和TNC表达与胶质瘤的恶性程度呈正相关(P0.05)。生存分析显示,NOTCH3、MYD88、MSN、HLA-A、STAT3、CD276和TNC的表达水平与DFS和OS呈负相关(P0.05)。5.通过对TCGA 数据库下载GBM和LGG的Illumina Human Methylation 450数据进行差异性表达分析,我们发现胶质瘤中MRC2甲基化水平较正常脑组织降低(P0.05);MRC2甲基化水平与MRC2的表达呈负相关(P0.05);1个位于Promotor区域的CpG位点(cg14764661)和8个位于Intron 1区域的CpG位点(cg00679546、cg05651778、cg11628739、cg24368031、cg13659446、cg14237903、cg16200799、cg17226280)的甲基化水平与MRC2的表达呈负相关;结合生存分析,胶质瘤中MRC2表达增高与其低甲基化状态相关,且MRC2低甲基化合并高表达状态的患者生存期会相应缩短。4.免疫组化实验证明,GALNT7和MRC2在GBM、LGG和正常脑组织中呈差异性表达(P0.05),两者在GBM中表达最高,LGG中表达次之,正常脑组织中表达最低,这说明GALNT7和MRC2表达量与恶性程度呈正相关。此外,Western Blot实验检测正常脑组织、Ⅲ级胶质瘤病人样品及胶质瘤细胞株(U373、A172)中MRC2的表达量,结果发现,与正常脑组织样品组相比,MRC2在Ⅲ级胶质瘤病人样品及胶质瘤细胞株中的表达量明显上调,结果存在统计学差异(P0.05)。结论:通过分析TCGA、KGEE和GTEx为代表的大数据库内胶质瘤相关数据,可对胶质瘤特异性生物标志物进行大规模筛查。以此为基础筛选出的在胶质瘤中特异性高表达的基因GALNT7和MRC2,可通过多条信号通路影响胶质瘤细胞的增殖、侵袭等生物学功能,并最终影响患者预后,可作为胶质瘤的早期检测、诊断和治疗的特异性生物学标志物。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.4
【图文】：

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图２．差异性表达基因筛选：Ａ．胶质瘤中ｍＲＮＡ差异性表达基因火山图；Ｂ．胶逡逑质瘤中ｍＲＮＡ差异性表达基因热图

免疫组化,级别,统计学意义

图４．免疫组化结果提示ＧＡＬＮＴ７在正常脑组织（Ａ）内表达低，ＩＩＩ级（Ｃ）、ＩＶ级（Ｄ）中表达依次增高，这说明表达量与肿瘤级别呈正尸＜０．０５），差异存在统计学意义。逡逑

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