组蛋白甲基转移酶G9a对胶质母细胞瘤细胞增殖和自噬的影响及其机制研究

发布时间：2020-07-02 19:02

【摘要】：脑胶质瘤是最常见的颅内原发性肿瘤,约占整个颅内原发性肿瘤的40%-50%,本研究中的大脑半球胶质瘤约占全部胶质瘤的51%左右。以肿瘤细胞的来源分类,脑胶质瘤以星型细胞瘤为最多,其次是少突胶质瘤和少突星型细胞瘤。以星型细胞瘤的恶性程度又可将其划分为I,II,III,IV四个级别,其中I级为星型细胞瘤,II级为浸润型细胞瘤,III级为间变型细胞瘤,IV级为胶质母细胞瘤,是恶性程度最高的一种脑胶质瘤。恶性胶质瘤年发病率约为5/100,000,每年新发病例超过14,000例,65岁以上常见。胶质母细胞瘤细胞的迁移侵袭能力很强又加之肿瘤病灶位于大脑这个关键区域,患者预后较差,当前的IV级胶质瘤平均生存期为14.6月,临床治疗难度很高[1-3]。研究已知胶质母细胞瘤的关键原癌基因为c-Myc。一般认为遗传因素是导致脑胶质瘤产生的重要原因之一[4-5],并且近几年研究者们发现组蛋白甲基化转移酶G9a在多种类型的肿瘤细胞中均高表达,这种高表达导致的异常的组蛋白甲基化修饰往往能够引起靶基因表达活性的改变,从而诱导肿瘤的发生。而下调G9a蛋白的表达或是G9a蛋白特异性小分子抑制剂的应用则会引起肿瘤细胞的增殖抑制、迁移侵袭能力减弱以及自噬等现象的产生[6-8]。虽然关于组蛋白甲基化转移酶G9a在胶质母细胞瘤中作用的研究已有报道,但有关G9a蛋白在胶质母细胞瘤细胞系中与胶质母细胞瘤原癌基因c-Myc之间相互作用的机制研究却几乎没有。因此本研究着眼于探究组蛋白甲基化转移酶G9a对胶质母细胞瘤细胞增殖、迁移侵袭和自噬过程的影响以及其对胶质母细胞瘤原癌基因c-Myc的调控机制,以期能为脑胶质瘤的临床治疗提供新思路。以下是本论文的主要发现:1.组蛋白甲基转移酶G9a影响胶质母细胞瘤细胞的增殖与成瘤我们采用Western blot技术检测到G9a蛋白在胶质母细胞瘤细胞系中普遍高表达。接着我们利用慢病毒介导的shRNA干涉技术以及G9a蛋白的特异性抑制剂BIX01294,在LN-229和U-87 MG细胞系中分别对G9a蛋白的表达进行了下调以及功能抑制。CCK8细胞活力实验以及Ki67细胞免疫荧光实验结果均显示,G9asi和被BIX01294处理过的细胞的增殖能力都明显受到抑制且细胞流式实验结果显示细胞增殖过程被抑制在了G2期。接着Western blot结果显示G9asi细胞以及被BIX01294处理过的细胞中与增殖相关的关键蛋白的表达量均下调。接着软琼脂克隆实验结果显示G9asi细胞以及被BIX01294处理过的细胞的体外克隆形成能力均明显下降。最后我们通过建立荷瘤鼠模型,发现G9asi细胞以及被BIX01294处理过的细胞的体内成瘤能力均减弱。分析在R2-微阵列分析和可视化平台在线数据库中里搜索的组蛋白甲基化转移酶G9a的表达量与胶质母细胞瘤患者生存时间的关系数据得出,G9a蛋白的表达量越高,胶质母细胞瘤患者的预后效果相应越差。以上现象说明组蛋白甲基化转移酶G9a在胶质母细胞瘤细胞增殖以及成瘤的过程中发挥着积极的作用。2.组蛋白甲基转移酶G9a影响胶质母细胞瘤细胞的迁移侵袭首先我们进行了划痕实验,结果显示G9asi细胞以及被BIX01294处理过的细胞其迁移能力明显减弱。接着我们进行了Transwell实验,结果再一次显示G9asi细胞以及被BIX01294处理过的细胞其迁移侵袭能力明显减弱。最后我们采用Western blot技术检测了G9asi细胞以及被BIX01294处理过的细胞中与迁移侵袭相关的关键蛋白的表达情况,结果显示这些蛋白的表达量均发生了明显的下调。以上现象说明组蛋白甲基化转移酶G9a在胶质母细胞瘤细胞迁移侵袭的过程中发挥着积极的作用。3.组蛋白甲基转移酶G9a影响胶质母细胞瘤细胞的自噬我们在显微镜下观察到G9asi细胞以及被BIX01294处理过的细胞的形态发生了明显变化,即大量的小囊和液泡聚集在细胞核周围,在形态学上与自噬小体的结构非常相似。接着共聚焦实验结果显示在G9asi细胞以及被BIX01294处理过的细胞中,LC3B阳性斑的数量明显增加。最后我们采用Western blot技术检测了G9asi细胞以及被BIX01294处理过的细胞中与自噬相关的关键蛋白的表达情况,结果显示这些蛋白的表达量均发生了明显的变化。以上现象说明下调组蛋白甲基化转移酶G9a的表达量或是抑制其功能,均能诱导胶质母细胞瘤细胞发生自噬现象。4.组蛋白甲基转移酶G9a调控胶质母细胞瘤原癌基因c-Myc的转录过程c-Myc在胶质细胞瘤中被证实为重要的原癌基因。转录组结果预测:当组蛋白甲基化转移酶G9a蛋白的功能被抑制时,细胞中c-Myc基因的表达活性会被明显抑制。接着我们利用了Western blot技术检测到在G9asi细胞以及被BIX01294处理过的细胞中,c-Myc蛋白的表达量确实明显下调。接着我们在G9asi细胞以及被BIX01294处理过的细胞中过表达c-Myc。体外层面,我们通过CCK8细胞活力实验结果可以看出,相比较未过表达c-Myc前,细胞的增殖能力得到了一定恢复;通过软琼脂克隆实验结果可以看出,相比较未过表达c-Myc前,细胞的克隆形成能力也得到了一定恢复。然后我们进行了共聚焦实验,结果显示细胞中LC3B阳性斑的数量明显减少,即相比较未过表达c-Myc前,细胞的自噬现象得到了一定缓解。体内层面,我们通过建立荷瘤鼠模型发现,相比较未过表达c-Myc前,细胞的体内成瘤能力同样也得到了一定恢复。接着我们利用Western blot技术检测到在G9asi细胞以及被BIX01294处理过的细胞中过表达c-Myc后,细胞中与增殖和自噬相关的关键蛋白的表达量同样得到了一定恢复。最后基于以上现象,我们进行了ChIP-qPCR实验以及双荧光素酶报告基因实验。结果显示G9a蛋白与c-Myc启动子区域直接结合,暗示组蛋白甲基化转移酶G9a可直接调控胶质母细胞瘤原癌基因c-Myc的转录过程,从而影响胶质母细胞瘤整个发生发展的过程。综上所述,组蛋白甲基化转移酶G9a对胶质母细胞瘤细胞的增殖、成瘤、迁移侵袭以及自噬过程都具有重要作用;组蛋白甲基化转移酶G9a可以直接通过调控胶质母细胞瘤原癌基因c-Myc的转录过程来影响胶质母细胞瘤的整个发生发展进程。本研究结果以期为胶质母细胞瘤的临床治疗提供新策略,同时丰富该疾病的理论研究基础。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.4
【图文】：

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【参考文献】