原子力显微镜研究survivin蛋白与抗体、稀土离子铈（Ⅲ）的相互作用

发布时间：2020-07-04 11:17

【摘要】：目的1.采用原子力显微镜分子级成像技术从单分子水平研究神经系统关键蛋白survivin与抗体的相互作用,在接近蛋白自然条件下揭示其三维结构和作用域,以便我们更直观理解survivin在胶质瘤发生和神经损伤恢复中的分子作用机制及作用。2.选取肿瘤细胞凋亡抑制蛋白survivin,在近生理环境中使之与稀土离子铈(Ce~(3+))发生作用;再通过原子力显微镜(AFM)对目标物的精细结构进行成像;实现在单分子水平上研究稀土小分子与目标物的作用域。揭示稀土对抑制凋亡关键蛋白的作用方式与肿瘤细胞凋亡间的内在联系。方法1.选取survivin蛋白,高纯水稀释至0.2 ng/mL,survivin兔多克隆抗体稀释至400 ng/mL,取5μL 0.04 ng/mL的survivin蛋白滴到新剥离的云母片上静置制样后用AFM观测;取5μL 40 ng/mL的survivin兔多克隆抗体滴到云母片上静置制样后用AFM观测;用微量移液器取20μL 0.2ng/mL的survivin蛋白,取10μL 400 ng/mL的survivin抗体,加70μL高纯水稀释后,振摇2 min后分别在25℃,37℃,45℃下孕育相应时间后,取5μL survivin蛋白和survivin抗体的混合液滴到云母片上静置制样后用AFM观测。样品检测都采用AFM的敲击模式。2.选取survivin蛋白,高纯水稀释至0.2 ng/mL,选取铈标准溶液分别稀释至100μg/mL和10μg/mL,用微量移液器取5μL 0.02 ng/mL的survivin蛋白滴到新剥离的云母片上静置制样后用AFM观测;取5μL 10μg/mL的Ce~(3+)水溶液滴到新剥离的云母片上静置制样后用AFM观测;用微量移液器取10μL 0.2 ng/mL的survivin蛋白,用微量移液器取相应体积的100μg/mL或10μg/mL的Ce~(3+)水溶液,加适量高纯水稀释后,配成所需浓度的溶液,振摇2 min后分别在25℃,37℃,45℃下孕育相应时间后,用微量移液器取5μL survivin蛋白和Ce~(3+)的混合液滴到新剥离的云母片上静置制样后用AFM观测;样品检测都采用AFM的敲击模式。结果1.对survivin蛋白同源二聚体的原子力显微镜观测表明:在水溶液中survivin蛋白主要以7-8 nm大小的分散体存在,高分辨AFM图可以清晰地看到survivin蛋白的结构域和两个α螺旋。2.抗体三维结构的高分辨AFM图像表明:Y形结构的IgG分布在球状结构的牛血清白蛋白之中,在AFM图中二者可以通过结构差异很容易区分。高分辨AFM图揭示IgG的三个相对独立并且有柔性链链接的Y型复合结构,可以获得Ig G更细节的结构域。3.温度对survivin蛋白与survivin蛋白抗体相互作用的影响不同,25℃时survivin-抗体结合单元的三区域组合成的Y形结构和球形或心形的粒子;37℃时除了可以发现Y形survivin-抗体结合单元外,还有单个的球形BSA;45℃时很多长短不同的链状结构大量出现,单个BSA蛋白的结构也变得松散。高分辨AFM图表明在45℃下,survivin-抗体结合单元只有局部还保持二级结构,整体已经成为链状,周围分布了各种长短的链状结构。4.温度对survivin蛋白结构的影响不同,25℃下蛋白团聚比较严重;37℃下6-8 nm大小的粒子明显增多,小粒子和大粒子数目明显减少;45℃下溶液中5-12 nm粒子总数减少明显,且不再看到溶液中有大于15 nm的大粒子存在,粒子间边界比较明显,蛋白有破损,有链状结构形成;37℃下survivin蛋白更多以6-8 nm的双粒子结合体形式存在;45℃下Ce~(3+)在云母片上形成10 nm左右的大小均匀,边缘光滑的结晶形结构。5.不同Ce~(3+)浓度对survivin蛋白结构的影响不同,37℃下survivin蛋白在水溶液中大部分得到均匀分散,粒子的边缘能观察到伸出的侧链结构,经过1μg/mL的Ce~(3+)作用后,粒子聚集为更大一些的较为均匀的粒子,粒子的边缘具有类似绒毛的侧链结构;经过5μg/mL的Ce~(3+)作用后的粒子总数增多,一些更的大粒子开始出现,粒子边缘开始变平滑,类似绒毛的侧链结构不再清晰,10μg/mL的Ce~(3+)作用后的survivin蛋白粒子继续变大,粒子边缘更为平滑紧致,小粒子变得松散,有少量的线装肽段出现;50μg/mL的Ce~(3+)作用后有更大的粒子组合形成,基底出现规则的硝酸铈结晶的堆集。6.Ce~(3+)与survivin蛋白作用不同时间和不同温度对其结构的影响不同,survivin蛋白与Ce~(3+)在25℃下作用10 min后,在水溶液中形成大小不等的粒子,作用20 min后,在水溶液中8-10 nm大小的粒子明显增多,超过5-9 nm的粒子占据主要地位,20-30 nm的团聚也有所增多,作用30 min后形成了更多的形态各异的大的组合,有的超过60 nm,在37℃下作用10,20和30 min后具有类似的变化,在45℃下随着作用时间的增加,聚合增多,并伴随结构的改变和破碎肽段的出现。结论1.适宜温度对蛋白三级结构保持的重要性,结果表明survivin蛋白与抗体的结合在37℃比较适宜,这样既能防止低温下的团聚作用又能避免高温对其三级结构的破坏。2.低温对survivin蛋白大团聚的分散不利,低温有助于保持survivin蛋白以单体的形式存在,不利于二聚体的快速形成。较高的温度能快速分散原来存在的团聚物,但其副作用是对survivin蛋白三级结构有一定程度的破坏,三级结构展开成肽链。在37℃接近生理条件的环境下,这两种影响能更好的得到平衡。3.低浓度Ce~(3+)对survivin蛋白功能有两个方面的影响:一是通过四聚体的形成减少溶液中survivin蛋白的密度,二是通过使溶液中的survivin二聚体解聚为survivin单体减少溶液中survivin蛋白的有效密度,高浓度Ce~(3+)对survivin蛋白功能的影响主要是抑制和损坏:除了通过聚合作用减少溶液中survivin蛋白的有效密度,还存在对其功能域的改变和破坏。4.时间的影响表现在:随时间的增加,Ce~(3+)连接survivin蛋白二聚体成为更大的结构,多聚体数量增加。温度影响表现在两方面:一方面温度能加速Ce~(3+)对survivin蛋白的聚合过程,另一方面温度能增加Ce~(3+)对survivin蛋白三级结构的改变和破坏作用。较低温度下以survivin蛋白二聚体向survivin蛋白多聚体转化为主;在近生理温度下,一方面也存在上述的这种单向聚合过程,而且这种过程由于温度的适宜变得更快,在短时间内能完成survivin蛋白二聚体向多聚体的转变,除此之外还存在Ce~(3+)对survivin蛋白结构的改变和survivin蛋白多聚体的解聚;在较高温度下,Ce~(3+)不仅能改变survivin蛋白的三级结构,而且能对肽链造成损坏,使之部分成为肽段。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.4
【图文】：

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29第一部分附图图1.1. 溶液中的survivin蛋白二聚体结构的高分辨AFM图a-c) 分别以worms , space fill和 ball and stick方式表示的survivin蛋白二聚体的三维结构图（PDB ID: MMDB_1XOX）， d) Survivin蛋白的AFM图, e) 放大的survivin蛋白的AFM图(d图红色框选定区域), f) Survivin蛋白的高分辨AFM图(e图中红色框选定survivin蛋白)，内图为以wire方式表示的survivin抗体的三维结构图(来源于MMDB_1XOX)， g)大范围survivin蛋白分布的AFM图, h) Survivin蛋白的粒子分布柱状图, i) 粒子长，宽与粒子等面积圆直径的相互关系图。

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重庆医科大学博士研究生学位论文31图1.2. 溶液中的survivin抗体与BSA结构的高分辨AFM图a)以 worms 方式表示的 survivin 抗体的 X 射线晶体学数据三维结构图(来源于 MMDB_1IGT)，b)以 worms 方式表示的 BSA 的 X 射线晶体学数据三维结构图 (来源于 MMDB_4ORO)， c)溶液中分布的 survivin 抗体与 BSA 的大范围扫描的 AFM 图, d) 选定的 survivin 抗体的高分辨 AFM 图(c 图中红色框选定区域)，内图为以 wire 方式表示的 survivin 抗体的三维结构图(来源于 MMDB_3CM9), e) BSA 的高分辨 AFM 图(c 图中绿色框选定区域)，内图为以 ball andstick 方式表示的 BSA 晶体的三维结构图(来源于 MMDB_4ORO), f) Survivin 抗体 IgG 的三维立体图。

【参考文献】