双载纳米胶束抗胶质母细胞瘤细胞体外研究

发布时间：2020-07-07 05:50

【摘要】：背景胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)是颅内常见的原发性恶性肿瘤,起源于神经上皮细胞。目前主要的治疗途径是手术切除联合术后放化疗,但预后较差,生存率较低。主要原因一方面是肿瘤呈浸润性生长且大多处于颅内重要部位,手术往往不能彻底切除;另一方面是化疗药物难以跨过血脑屏障到达肿瘤部位且单一药物治疗效果较差。因此,新的治疗策略亟待研究,联合应用两种或多种药物并靶向递送到肿瘤部位成为肿瘤治疗策略研究的热点。姜黄素(Curcumin,CUR)是从植物姜黄中提取的黄色多酚类天然活性物质,研究表明CUR具有增敏、抗炎、抗癌等多种药理作用,其中抗癌作用已在动物实验中得到反复验证,但较差的水溶性限制了其应用;阿霉素(Doxorubicin,DOX)是临床常用广谱抗肿瘤药物,存在治疗窗短,耐药性强,心脏毒性大等问题,有研究证实DOX与其他药物联合应用能够提高其抗肿瘤效果并逆转多药耐药。随着纳米医学的出现,纳米结构的物理和化学性质与药物有效递送到肿瘤细胞的能力的关系被阐明,纳米载药系统因其能够提高药物利用率,增加药物水溶性,延长药物体内循环时间,实现肿瘤靶向及药物共递送等优点受到关注,使用纳米载药复合物已成为神经胶质母细胞瘤诊治的潜在策略。有研究证明通过纳米颗粒(Nanoparticles,NPs)共递送不同药物能够有效提高药物疗效并实现药物协同作用,具有广阔的应用前景。近几年,有文献报道将化疗药物包载入NPs中可以显著增强抗胶质母细胞瘤的效果,但不同类型纳米颗粒及化疗药物作用于不同肿瘤的效果具有一定差别,优良的制备方案及合适的诊疗策略仍亟待研究。本文采用薄膜水化法利用聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)包裹CUR和DOX自组装制备出共载DOX和CUR的纳米胶束PEG/DOX/CUR,并探讨了DOX和CUR协同作用、PEG/DOX/CUR抗胶质母细胞瘤细胞的作用及其进入细胞的机制。目的探讨PEG/DOX/CUR体外抗胶质母细胞瘤细胞的作用、DOX和CUR的协同作用及细胞摄取PEG/DOX/CUR的机制。方法1.制备并表征PEG/DOX/CUR。根据单因素考察法筛选出PEG/DOX/CUR的最优制备方法。利用扫描电子显微镜、粒径电势扫描仪、荧光分光光度计、核磁共振波谱仪等对PEG/DOX/CUR进行表征;利用透析袋模拟体内释放环境,测定DOX和CUR从PEG/DOX/CUR中释放的效率;通过调节pH,模拟肿瘤组织环境,研究PEG/DOX/CUR在酸性环境中释放DOX和CUR效率;2.研究DOX和CUR的协同作用及PEG/DOX/CUR抗胶质母细胞瘤细胞的作用。通过细胞毒性实验测定细胞存活率,利用公式计算半数抑制浓度(50%Inhibiting concentration,IC50)及药物联合作用指数(Combination index,CI);通过钙黄绿素(Calcein,CA)/碘化丙啶(Propidium iodide,PI)双染实验检测PEG/DOX/CUR的促细胞凋亡作用;通过划痕实验研究PEG/DOX/CUR抑制细胞迁移的能力;3.探究PEG/DOX/CUR细胞摄取机制。利用共聚焦超分辨显微镜观察PEG/DOX/CUR的细胞内化;利用流式细胞仪量化分析细胞摄取效率;通过抑制细胞跨膜转运通道研究PEG/DOX/CUR进入细胞的机制。结果1.成功构建了双载纳米胶束PEG/DOX/CUR。投药浓度为0.5 mg/mL,投药比DOX:CUR:PEG为1:1:7,使用薄膜水化法构建的PEG/DOX/CUR粒径最小,平均粒径约60nm,多分散系数(Polydispersity index,PDI)小于0.2,Zeta电位约-47 mV,DOX与CUR包封率均大于90%,载药量约为8%,PEG/DOX/CUR稳定性良好;双载纳米胶束PEG/DOX/CUR具有缓慢释药的效果,体外释放结果表明PEG/DOX/CUR中DOX和CUR呈现缓慢释放现象,且在酸性环境中DOX和CUR释放较快;2.双载纳米胶束PEG/DOX/CUR具有抗胶质母细胞瘤的作用。细胞毒性实验结果显示DOX和CUR联合应用具有协同作用,空白NPs对细胞无明显毒性,PEG/DOX/CUR能够有效地促进细胞凋亡并抑制细胞迁移,不同浓度的PEG/DOX/CUR均具有协同抑制胶质母细胞瘤细胞的作用;3.双载纳米胶束PEG/DOX/CUR主要通过小窝蛋白介导的内吞途径进入细胞。细胞摄取实验结果显示PEG/DOX/CUR能够有效地进入细胞且具有时间、能量依赖性,表明双载纳米胶束PEG/DOX/CUR主要通过内吞途径进入细胞;内吞途径实验结果表明PEG/DOX/CUR主要通过小窝蛋白介导的内吞途径进入细胞。结论成功构建了PEG/DOX/CUR,粒径小,稳定性好且具有缓慢释放的特性;PEG/DOX/CUR具有抗胶质母细胞瘤细胞的作用且DOX和CUR具有协同作用;PEG/DOX/CUR进入细胞的途径主要是小窝蛋白介导的内吞途径。
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.41
【图文】：

曲线,紫外光谱,含量测定方法,吸收光谱

实验结果3 实验结果3.1 PEG/DOX/CUR 制备及表征3.1.1 紫外分光光度计测定 DOX 含量方法的确定紫外光谱显示 DOX 最大吸收峰位于 500 nm 处，特征性检测结果显示，在 500 nm 处CUR 及空白 NPs 对阿霉素的吸收无干扰，所以选择 500 nm 作为 DOX 标准曲线测定波长。以 500 nm 处 DOX 的吸光度为纵坐标，DOX 的浓度为横坐标，绘制出标准曲线，结果显示线性关系良好。Y=0.01487 x+0.06196，R2=0.9999.

含量测定方法,投料比,薄膜水,包封率

图 2 CUR 含量测定方法的确定。a是 CUR荧光光谱；b 是 CUR专属性荧光光谱；c 是 CUR浓度标准曲线。3.1.3 PEG/DOX/CUR 的制备表 1 是利用纳米沉淀法、透析法、薄膜水化法制备的 PEG/DOX/CUR 的各项参数，结果显示使用不同制备方法得到的 PEG/DOX/CUR的电位、分散系数及 DOX和 CUR的包封率无明显差异，薄膜水化法制备得到的 PEG/DOX/CUR 粒径最小，因此，选用薄膜水化法制备 PEG/DOX/CUR；表 2 是采用不同投料比制备的 PEG/DOX/CUR，结果显示随着 PEG用量增多，PEG/DOX/CUR粒径、分散系数逐渐降低，包封率逐渐增高；投料比为1:1:7和1:1:8 时，粒径、电位及包封率基本无差别，但 1:1:8 的投料比制备的 PEG/DOX/CUR PDI较大，可能是由于过多的 PEG形成了未包裹药物的较小空白纳米颗粒，增大了 PDI，另外，增加 PEG 用量也存在毒性增加的风险，因此，本研究选取 1:1:7 的投料比进行后续实验；表 3 为投药浓度对 PEG/DOX/CUR 制备的影响，结果显示，投药浓度为 0.5 mg/mL时各项

氢谱,核磁

图 3 核磁氢谱。a为 CUR核磁氢谱，b 为 DOX核磁氢谱；c 为 PEG/DOX/CUR 核磁氢谱。3.1.5 PEG/DOX/CUR 紫外及荧光光谱图 4是 PEG/DOX/CUR 的紫外及荧光光谱，结果显示包载了 CUR 和 DOX的PEG/DOX/CUR 在 500 nm-600 nm 处有一个较宽的荧光发射峰，是 CUR 和 DOX 内在荧光性质所致，为直接使用荧光显微镜观察细胞摄取及内吞机制提供了基础。

【参考文献】