颅内动脉瘤环状RNA表达谱及circSNX6功能和作用机制初步研究

发布时间：2020-07-08 02:03

【摘要】：颅内动脉瘤是一种常见的脑血管疾病,人群患病率为3.2%~5.0%。随着神经影像技术的发展,越来越多的未破裂颅内动脉瘤被检出。绝大多数未破裂动脉瘤并不会表现出特殊症状,但一旦破裂则导致动脉瘤性蛛网膜下腔出血,致死率极高,大约60%~70%的患者还未来得及就医就已经死亡,对人类的生命健康构成严重威胁。对于偶然发现的未破裂颅内动脉瘤患者,大多数选择通过外科干预来预防动脉瘤破裂引起的严重后果。颅内动脉瘤的外科手术治疗主要包括开颅夹闭和血管内介入栓塞治疗两种方法,但无论是哪种方法,都存在相应的手术风险及手术费用高昂等一系列问题。因此,从研究颅内动脉瘤发病的病理生理学机制入手,寻找颅内动脉瘤的无创治疗(如药物治疗)靶点,预防或逆转动脉瘤的进展,成为目前研究的主要方向。越来越多的研究表明遗传因素和表观遗传学因素可能在颅内动脉瘤的发生、发展过程中起着重要作用,其中,研究非编码RNA的基因表达调控作用是探索颅内动脉瘤表观遗传学机制、寻找有效诊断和治疗靶点的重要途经。环状RNA(circRNA)是一种新近发现的基因表达调控因子,它是一种通过特殊的反向剪接机制由线性RNA前体的5’端和3’端共价相接形成非编码RNA,具有结构稳定、序列保守、组织特异性和发育阶段特异性的特点。目前已证实circRNA可通过“miRNA海绵”、结合RNA结合蛋白以及影响线性RNA剪接等方式发挥基因表达调控作用,而且越来越多研究证明其与临床上的多种疾病密切相关,包括心脑血管疾病、神经系统疾病和恶性肿瘤等。目前疾病相关circRNA的研究工作主要分为两个方面,一是通过利用高通量测序或基因芯片技术检测疾病相关的细胞或组织中circRNA表达水平,并利用生物信息学方法构建和分析circRNA表达谱;二是通过各种实验方法研究circRNA在疾病中的生物学功能。迄今为止,尚无研究报道颅内动脉瘤相关的circRNA表达谱以及circRNA在颅内动脉瘤中的生物学功能。因此,我们进行了本研究,从颅内动脉瘤circRNA表达谱的构建、差异circRNA的表达验证以及关键circRNA的功能和机制探索三个方面开展,旨在研究circRNA在颅内动脉瘤形成和破裂中的作用。第一部分颅内动脉瘤相关circRNA表达谱分析目的:构建颅内动脉瘤相关circRNA表达谱,筛选差异表达基因并对其功能进行预测,为后续研究circRNA在颅内动脉瘤中的生物学作用奠定基础。方法:收集16例颅内动脉瘤(破裂动脉瘤和未破裂动脉瘤各8例)和8例颞浅动脉组织样本,提取总RNA并富集其中的circRNA,利用高通量测序技术对组织的circRNA进行检测,使用软件进行序列比对和注释获得circRNA表达谱;取差异倍数≥2倍且p0.05作为筛选差异circRNA的阈值,获得差异表达的circRNA;然后对差异circRNA的宿主基因进行GO分析和KEGG通路富集分析,以推测circRNA的功能。结果:在24个组织标本中共获得25,980个circRNA,经过统计分析筛选出了颅内动脉瘤和颞浅动脉对照之间、破裂动脉瘤和未破裂动脉瘤之间差异表达显著的circRNA分别为1,054个和1,394个,其中分别有782个和1,087个circRNA在两种对比方式中呈下调表达;差异表达circRNA宿主基因GO分析和KEGG分析结果显示,发现它们可能参与了血管平滑肌细胞收缩、细胞骨架蛋白代谢以及TGF-β信号通路、MAPK信号通路等多个生物学过程。结论:circRNA在颅内动脉瘤与颞浅动脉之间和破裂动脉瘤与未破裂动脉瘤之间差异表达明显,差异表达的circRNA中多数为下调表达,差异表达的circRNA功能与颅内动脉瘤可能存在密切关联。第二部分颅内动脉瘤相关差异circRNA验证及关键circRNA-miRNA相互作用预测目的:验证测序获得的差异circRNA的表达水平,检验差异circRNA的真实性,对关键circRNA进行靶基因预测,为下一步功能研究提供基础。方法:另外收集20例颅内动脉瘤(破裂动脉瘤和未破裂动脉瘤各10例)和16例颞浅动脉组织样本,设计circRNA特异性背靠背引物,选取颅内动脉瘤对比颞浅动脉对照和破裂动脉瘤对比未破裂动脉瘤差异结果中上调和下调表达最显著的外显子来源circRNA各5个,进行qPCR检测验证这些circRNA的表达差异;对PCR产物进行Sanger测序,根据得到的序列中是否含有特异性反向剪接位点来验证qPCR结果的可靠性;利用RNase R消化来验证差异circRNA的稳定性;选择circSNX6作为研究对象,利用靶基因预测数据库对其进行circRNA-miRNA-mRNA相互作用预测,最后使用Cytoscape软件绘制circRNA-miRNA-mRNA互作网络图。结果:qP CR检测了20种cricRNA的表达水平,结果显示10种circRNA表达水平有显著差异,与测序结果一致,其余10种也表现出与测序结果相一致的表达趋势,但未达到统计学差异;Sanger测序结果显示PCR扩增产物准确地包含特异性反向剪接位点;RNase R消化后线性RNA对照表达量显著下降,而各差异circRNA表达量保持相对稳定;靶基因预测结果显示circSNX6序列中存在hsa-miR-145-5p、hsa-miR-16-5p和hsa-miR-195-5p的结合位点。结论:颅内动脉瘤相关差异circRNA表达谱结果稳定可靠,circSNX6可能通过结合hsa-miR-145-5p、hsa-miR-16-5p和hsa-miR-195-5p发挥作用。第三部分circSNX6在颅内动脉瘤中的功能和作用机制初步研究目的:初步探索circSNX6在颅内动脉瘤中的功能和作用机制。方法:根据高通量测序结果和circBase数据库检索结果分析circSNX6的序列特征。利用人脑血管平滑肌细胞(HBVSMC)作为研究对象,核质分离实验检测circSNX6的亚细胞定位。TNF-α刺激HBVSMC构建平滑肌细胞表型转化模型并检测circSNX6的表达水平。构建circSNX6过表达质粒,并转染HBVSMC,qPCR检测过表达质粒的转染效率;对HBVSMC过表达circSNX6,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,CCK8法检测细胞的增殖能力,qPCR和Western blot检测平滑肌细胞表型转化相关标志物的表达水平;qPCR检测circSNX6过表达后下游靶miRNA的表达量变化,分析与circSNX6负向调节表达的miRNA,推测其相互作用关系,最后利用starBase和miRanda分析序列结合的特异性。结果:circSNX6是一个由14号染色体上SNX6(NM_021249)基因中第2-8个外显子首尾相连而成的circRNA,含有740个碱基。核质分离实验结果显示circSNX6的亚细胞定位主要在细胞质中。在平滑肌细胞表型转化后circSNX6的表达水平显著升高。circSNX6过表达载体转染HBVSMC后circSNX6的表达水平明显升高,细胞迁移和细胞增殖能力明显提高,qPCR和Western blot结果显示:收缩型平滑肌细胞标志物(α-SMA和calponin)表达下降,合成分泌型标志物(MMP9)表达升高;过表达circSNX6后miR-195的表达水平显著下降,提示miR-195可能受到circSNX6的负向调节;circSNX6中与miR-195结合的序列类型为7mer-m8型,表现出较高的特异性。结论:circSNX6可通过影响平滑肌细胞的表型转化,参与动脉瘤的发生发展。circSNX6的功能可能通过抑制miR-195的功能介导。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R743
【图文】：

图 1-1：组织样本 RNA 变性琼脂糖凝胶电泳图（二）颅内动脉瘤 circRNA 表达谱初步分析1、circRNA 表达谱基本概况每个组织样本平均可检测出近 8,000 万个高质量的原始读数，其中 80 %以上能对到人类参考基因组上（表 1-3）；通过注释，这些组织样本共鉴定出 25,980 个NA，韦恩图显示三组样本共同表达的 circRNA 有 4,679 个（图 1-2）。

图 1-1：组织样本 RNA 变性琼脂糖凝胶电泳图脉瘤 circRNA 表达谱初步分析达谱基本概况均可检测出近 8,000 万个高质量的原始读数，因组上（表 1-3）；通过注释，这些组织样本共三组样本共同表达的 circRNA 有 4,679 个（

图 1-5：circRNA 染色体分布2、差异 circRNA 表达谱分析们对三组样本通过两种方式进行比较分析：颅内动脉瘤 vs 对照组，破 未破裂动脉瘤。通过统计分析，得出如下结果：（1）颅内动脉瘤 vs 对照著性差异的 circRNA 共有 1,054 个，其中动脉瘤中上调表达的 272 个、782 个；（2）破裂动脉瘤 vs 未破裂动脉瘤：表达有显著性差异的 circRN 个，其中破裂动脉瘤中上调表达的 307 个、下调表达的 1,087 个。我们火山图显示出有统计学意义（p<0.05，差异倍数≥2.0）的差异表达的 c1-6，图 1-7）。据各组样本中 circRNA 表达分布不同，可将表达情况相近的样本聚类到分析：我们用热图直观的展示了各组样本之间的 circRNA 表达分布特高低，树状图显示各组内样本关系密切且不同组别有明显差异（图 1-8

【相似文献】

相关期刊论文 前6条

1 何宇辉;邓益森;彭畔新;王爱军;张晓云;李俊杰;周晓峰;;非肌层浸润性膀胱癌环状RNA表达谱及生物信息学分析[J];中日友好医院学报;2018年03期

2 竺红;罗云霞;周艳;杨亚珊;;原发性干燥综合征患者外周血环状RNA表达谱研究[J];皖南医学院学报;2018年05期

3 张韶岩;曾小莉;郭琳;区颂雷;马旭晨;;非小细胞肺癌环状RNA表达谱的差异分析[J];中华肺部疾病杂志(电子版);2018年02期

4 赵云峰;张明周;游雅婷;钱澜兰;郭亮;吴学玲;;胸膜转移性肺癌环状RNA表达谱及其临床意义[J];中华肺部疾病杂志(电子版);2017年06期

5 李冰冰;王哲;曹亚兵;林丹;范国强;;丛枝病对白花泡桐环状RNA表达谱变化的影响[J];河南农业大学学报;2018年03期

6 李楠;苑召虎;陈小洁;黄建云;张怡宇;魏亚明;;储存血小板差异性长链非编码RNA表达谱研究[J];中国输血杂志;2018年01期

相关会议论文 前2条

1 李泽汉;潘引;汪延秋;李娜;闫明;于金华;;人根尖牙乳头干细胞成骨分化相关的环状RNA表达谱特征[A];中华口腔医学会第十一次全国牙体牙髓病学学术大会论文汇编[C];2018年

2 李泽汉;潘引;汪延秋;李娜;闫明;于金华;;人根尖牙乳头干细胞成骨分化相关的环状RNA表达谱特征[A];2018全国口腔生物医学学术年会论文汇编[C];2018年

相关博士学位论文 前2条

1 王川川;颅内动脉瘤环状RNA表达谱及circSNX6功能和作用机制初步研究[D];中国人民解放军海军军医大学;2019年

2 李海侠;系统性红斑狼疮环状RNA表达谱研究及潜在分子标志物的筛选与鉴定[D];南方医科大学;2018年

相关硕士学位论文 前5条

1 焦义然;小麦春化相关小RNA表达谱分析及光照促进春化的机理研究[D];河北科技大学;2019年

2 黄静妍;缺血性脑卒中风痰瘀阻证环状RNA表达谱研究[D];广西中医药大学;2018年

3 温东樾;超声引导下裸鼠肝癌移植瘤模型射频消融环状RNA表达谱的研究[D];广西医科大学;2018年

4 宋寒;应激致抑郁症小鼠海马CA1脑区的环状RNA表达谱分析[D];河北医科大学;2018年

5 邹天宇;冠心病环状RNA表达谱及其诊断价值分析[D];北京协和医学院;2018年

本文编号：2745934