MSCs源性外泌体促周围神经再生作用及机制的初步研究

发布时间：2020-07-08 08:00

【摘要】：目的:周围神经损伤是常见的神经系统性疾病,损伤后修复治疗的效果欠佳。因此,寻找改善周围神经损伤修复效果的新方法一直是临床焦点问题之一。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一类多能干细胞,最初在骨髓中被发现,具有多向分化潜能、造血支持、免疫调控和自我复制等特点,MSCs能分泌多种生长因子,以内分泌和旁分泌的方式促进组织修复,具有保护肾脏,减轻心肌缺血/再灌注损伤,也具有治疗脑中风和阿尔茨海默病的潜能,同时具有促进周围神经损伤修复等作用。外泌体(Exosome)是一种可由活性细胞分泌的纳米级脂质双层囊泡物质,含有某些生物活性分子(如siRNA、mRNA以及多种蛋白)。骨髓MSCs可产生丰富的外泌体,MSCs源性外泌体能模拟某些MSCs的生物学功能,逐渐被证实具有促进组织修复作用。MSCs促进周围神经损伤修复作用是否与其分泌的外泌体有关,少有文献报道。本文主要探讨MSCs源性的外泌体是否具有促进周围神经的再生作用及其效果,并对修复过程中的机制进行初步探讨。方法:建立SD大鼠右侧坐骨神经压榨(Crush)模型,模型大鼠的右侧腓肠肌分别注射PBS、外泌体、MSCs。(1)在术前和术后的14 d、术后28 d,分别进行步态分析,计算坐骨神经功能指数(SFI);热板实验测定热痛潜伏期。(2)术后14 d和28 d,取压榨位点近端和远端神经干,甲苯胺蓝染色计算远端神经再生的有髓纤维数量和直径。(3)术后14 d和28 d,取压榨位点远端神经干,免疫组化法观察S-100和NGF蛋白的表达改变。(4)术后7 d用Q-PCR方法检测提取DRG的Akt1、NGFr、PMP22、S100B、VEGFA和HGF基因mRNA的表达水平。结果:(1)术后14 d和28 d,外泌体组和MSCs组大鼠的右后肢的运动功能、红肿程度和各脚趾伸展程度均明显好于PBS组。SFI和热痛潜伏期的恢复程度,外泌体组和MSCs组显著好于PBS组,差异有统计学意义(p0.05)。其中术后14 d、28 d SFI值外泌体组优于MSCs组。(2)术后14 d和28 d,外泌体组和MSCs组再生有髓神经纤维数量、直径均明显优于PBS组,差异有统计学意义(p0.05),术后14 d和28 d外泌体组神经纤维数量多于MSCs组(p0.05)。(3)术后14 d和28 d,外泌体组和MSCs组S-100和NGF表达均比PBS组高(p0.05)。(4)术后7 d外泌体组和MSCs组DRG中PMP22、VEGFA、NGFr及S100B的mRNA表达水平升高(p0.05)。结论:(1)MSCs源性的外泌体能促进周围神经神经再生,其效果不亚于MSCs。(2)MSCs源性的外泌体可促进周围神经S-100B、NGFr、PMP-22、VEGFA的表达增高。
【学位授予单位】：海南医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R745
【图文】：

实验方法1 MSCs 和外泌体的提取及鉴定本研究实所用的 MSCs 和外泌体来源于课题组前期研究。首先我们在体养出纯化 MSCs 细胞，经流式细胞仪检测 MSCs 成对标记物 CD44/CD成功提取 MSCs。随后我们使用第 6 代 MSCs 提取外泌体，在透射电镜实了我们成功在 MSCs 中提取到外泌体，微流式检测的外泌体浓度3×109个/ml（图 1）。外泌体提取方法：MSCs P6 细胞在 T175 细胞瓶生汇合，PBS 漂洗 3 次，每次用 35 ml PBS，加入无血清培养基继续培养30 ml。经历72 h的无血清培养，摇晃几次后，收集上清用于提取外泌体。30 10 min，去除活细胞。留取上清。2000×g，离心 10 min，去除死细胞。1000离心 30 min，去除细胞碎片。留取上清。用 0.22 um 的一次性针头过滤菌。用Macrosep 超滤管将上清液浓缩至 9 ml 左右。100,000×g 离心 70 m200 ul PBS 重悬外泌体沉淀。-80oC 保存。

大鼠能够在通道里连续行走，保证实验的顺28 d 分别步态测定。SFI 的具体测定方法格为长 80 cm 、宽 10 cm 高 15 cm，两端开宽后铺于槽底（图 2-2），远端放一暗箱。肢双脚踝关节着色后，放于槽的开口端，端行走，每侧后肢各留下 4~5 个足印，选择侧足（E）的 3 个指标测量：①足印长度从足跟到足尖的距离；②足趾宽度（width1 趾到第 5 趾连线距离；③中间足趾距离（连线距离（如图 2-1）。将上述3 变量代入)/NPL+109.5(ETW-NTW)/-NTW+13.3(EIT-N代表假手术侧。公式计算结果 0%～-11%能完全丧失，-11%～-100%表示部分神经功

图 2-2 步态实验现场Figure 2-2 Gait experiment sceTL）测定 d、21d、28 d 分别进行热板一个透明观测柱状体，热板透明观测柱里，用秒表计时足记为大鼠的热刺激缩足为避免组织损伤，每次时量 3 次，取平均值评估热痛潜

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本文编号：2746303