脊髓背角星形胶质细胞的Cav3.2在神经病理性痛中的作用研究
发布时间：2020-07-10 16:04
【摘要】：目的:神经病理性疼痛(Neuropathic pain,NP)临床多见且治疗效果不够理想,有必要进一步探索其机制以揭示新的治疗靶点。脊髓背角(Spinal dorsal horn,SDH)是疼痛信号传导和局部加工的初级中枢。T型钙通道(Cav3)是低电压激活钙通道,可调控多种细胞的兴奋性。在NP动物模型中,SDH的Cav3被异常激活,表现为Cav3表达上调及神经元T型钙电流增加。此外,有研究发现星形胶质细胞中钙离子的内流可激活胞内一系列细胞因子的释放,从而激活周边神经元,以参与调控NP的发生发展。然而,Cav3的细胞亚型特异性表达与NP的产生和维持是否有关仍不清楚。因此,我们利用疼痛模型研究了疼痛时Cav3表达的变化,并探讨Cav3.2表达上调对星形胶质细胞激活的调控作用,以期为NP机制的研究和镇痛药物的开发提供新的理论依据。方法:选取成年雄性SD大鼠(150~200 g),建造福尔马林急性炎性痛和坐骨神经部分结扎(Partial sciatic nerve ligation,PSNL)慢性NP模型(部分动物同时实施鞘内置管术),并采用免疫组化染色、免疫印迹、qPCR方法观察SDH中Cav3表达的变化。通过双标免疫组化染色法,观察PSNL大鼠SDH中Cav3.2与GFAP、OX42、Neu N的共染情况。而后在PSNL大鼠连续鞘内给予Cav3通道阻滞剂米贝地尔与星形胶质细胞抑制剂氟代柠檬酸14天,并通过免疫组化染色观察药物对Cav3.2与GFAP在SDH表达的影响。结果:1.经后足皮下注射福尔马林的大鼠出现典型的双相伤害性反应,SDH中c-Fos蛋白表达明显增加,而Cav3各亚型的染色强度未见明显改变;2.PSNL术后大鼠术侧后爪出现机械痛敏,SDH中Cav3.2蛋白与mRNA表达在术后14天均显著增加,而Cav3.1和Cav3.3的染色强度未见明显变化;3.PSNL大鼠中增强的Cav3.2特异性染色与星形胶质细胞标记物GFAP共染,但与小胶质细胞标记物OX42及神经元核标记物NeuN未见明显共染;4.PSNL大鼠Cav3.2上调先于GFAP染色的增强:Cav3.2染色从术后1天开始增强,而GFAP染色从术后7天开始明显增强,并都持续到术后14天,但NeuN染色未见任何显著变化;5.连续鞘内给予米贝地尔可缓解PSNL诱导的机械痛敏,同时降低Cav3.2与GFAP的表达;而氟代柠檬酸在缓解痛敏时仅减少GFAP的表达,对Cav3.2的表达无明显作用。结论:急性炎性痛不影响SDH的Cav3表达;NP状态下SDH中Cav3.2表达增加,而Cav3.1和Cav3.3的表达不受影响。表达增加的Cav3.2主要位于星形胶质细胞上且发生在星形胶质细胞激活之前,而Cav3通道阻滞剂可产生镇痛作用并抑制Cav3.2和GFAP表达的增加,提示Cav3.2可能是NP发生发展过程中促进星形胶质细胞激活的一种新型调控因子。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R741
【图文】：
图 2.1 福尔马林炎性痛模型制备：右后足背皮下注射过程及大鼠缩足、舔足行为图。.3.2 大鼠神经病理性疼痛模型制备取雄性 SD 大鼠 70 只，随机分为模型组（PSNL，n = 54）和假手术组（Sha = 16）。模型组大鼠行 PSNL 手术，假手术组大鼠只暴露坐骨神经不结扎， Von Frey 法在术前及术后 1、3、7、10、14 天测定大鼠术侧（右）和对侧（左爪机械刺激缩足阈值，以评估机械痛敏的产生。模型组大鼠取材后行以下：1）免疫组化染色（n = 5/时间点）：分别在术后 1、3、7、10、14 天取材2）免疫印迹（n = 6）：术后 14 天取材；3）实时荧光定量 PCR（Real-time quantitative PCR，qPCR）（n = 6）：术4 天取材；4）经腰椎连续鞘内注射给药（n = 17）：连续鞘内注射给药后 14 天取材疫组化染色。假手术组大鼠在术后 14 天取材分别行免疫组化染色（n = 5）、免疫印迹（
PSNL 模型制备及机械痛敏评估。A：坐骨神经解剖示意图（红色线圈标示结扎NL 手术坐骨神经暴露与结扎图；B：电子 Von Frey 机械测痛仪监测缩足阈值图 经腰椎连续鞘内注射给药17 只雄性 SD 大鼠在行 PSNL 术前随机分为三组，即生理盐水组（i.t. Sa.25 μl/h 速率连续鞘内注射生理盐水作为对照，n = 5；米贝地尔组fradil）：以 0.7 μg/h[28]速率连续鞘内注射米贝地尔，n = 6；氟代柠檬酸i.t. Fluorocitrate）：以 1 nmol/h[47]速率连续鞘内注射 FC，n = 6。各组均束后立即开始连续鞘内给药并持续 14 天，给药胶囊内液体体积均为 渗透速率均为 0.25 μl/h。参照 Storkson[49]和 Chen[28]等人方法行腰椎穿刺置管术：雄性 SD 大鼠麻醉后，取俯卧位，背部去毛，常规碘伏消毒。在无菌操作条件下以髂棘连线与脊柱交点为中心作 2 cm 纵切口，分离肌肉暴露 L5-L6 棘突棘间韧带暴露黄韧带。去尖 22 G 针头穿刺黄韧带，观察到大鼠出现突甩尾后表示到达蛛网膜下腔，立即拔针。用镊子轻柔的将连接植入式药胶囊（0.25 μl/h，14-day）的 PE-10 导管（OD：0.5 mm，ID：0.25
22图 3.1 福尔马林诱导急性炎性痛对 SDH 中 Cav3 表达无明显影响。A：右后足背皮下注射生理盐水或福尔马林溶液后 60 min 内观察到的大鼠疼痛反应时间的比较；B：生理盐水与福尔马林注射后 SDH 中 c-Fos 蛋白（红色）表达阳性细胞的免疫组化染色代表图，标尺为 200 m；C：生理盐水组与福尔马林组大鼠 SDH 浅层（I-II）和深层（III-IV）c-Fos 阳性细胞计数的柱状图；D：生理盐水组与福尔马林组大鼠 SDH 注射侧 Cav3.1-3.3（绿色）的免疫组化染色代表图，标尺为 100 m；E：生理盐水组与福尔马林组 SDH Cav3.1-3.3 染色的相对平均荧光强度分析柱状图。各组 n = 6；* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001，福尔马林组与生理盐水组比较。为验证免疫组化染色抗体的特异性，我们进行了抗原预吸附实验，以检测SDH 中 Cav3.1-3.3 染色的特异性。如图 3.2 所示，图 B 为 Cav3.1-3.3 阳性对照染色图，可见 Cav3.1-3.3 在 SDH 均有明显染色（绿色）；而在图 A 的免疫预吸
本文编号：2749147
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R741
【图文】：
图 2.1 福尔马林炎性痛模型制备：右后足背皮下注射过程及大鼠缩足、舔足行为图。.3.2 大鼠神经病理性疼痛模型制备取雄性 SD 大鼠 70 只，随机分为模型组（PSNL，n = 54）和假手术组（Sha = 16）。模型组大鼠行 PSNL 手术，假手术组大鼠只暴露坐骨神经不结扎， Von Frey 法在术前及术后 1、3、7、10、14 天测定大鼠术侧（右）和对侧（左爪机械刺激缩足阈值，以评估机械痛敏的产生。模型组大鼠取材后行以下：1）免疫组化染色（n = 5/时间点）：分别在术后 1、3、7、10、14 天取材2）免疫印迹（n = 6）：术后 14 天取材；3）实时荧光定量 PCR（Real-time quantitative PCR，qPCR）（n = 6）：术4 天取材；4）经腰椎连续鞘内注射给药（n = 17）：连续鞘内注射给药后 14 天取材疫组化染色。假手术组大鼠在术后 14 天取材分别行免疫组化染色（n = 5）、免疫印迹（
PSNL 模型制备及机械痛敏评估。A：坐骨神经解剖示意图（红色线圈标示结扎NL 手术坐骨神经暴露与结扎图；B：电子 Von Frey 机械测痛仪监测缩足阈值图 经腰椎连续鞘内注射给药17 只雄性 SD 大鼠在行 PSNL 术前随机分为三组，即生理盐水组（i.t. Sa.25 μl/h 速率连续鞘内注射生理盐水作为对照，n = 5；米贝地尔组fradil）：以 0.7 μg/h[28]速率连续鞘内注射米贝地尔，n = 6；氟代柠檬酸i.t. Fluorocitrate）：以 1 nmol/h[47]速率连续鞘内注射 FC，n = 6。各组均束后立即开始连续鞘内给药并持续 14 天，给药胶囊内液体体积均为 渗透速率均为 0.25 μl/h。参照 Storkson[49]和 Chen[28]等人方法行腰椎穿刺置管术：雄性 SD 大鼠麻醉后，取俯卧位，背部去毛，常规碘伏消毒。在无菌操作条件下以髂棘连线与脊柱交点为中心作 2 cm 纵切口，分离肌肉暴露 L5-L6 棘突棘间韧带暴露黄韧带。去尖 22 G 针头穿刺黄韧带，观察到大鼠出现突甩尾后表示到达蛛网膜下腔，立即拔针。用镊子轻柔的将连接植入式药胶囊（0.25 μl/h，14-day）的 PE-10 导管（OD：0.5 mm，ID：0.25
22图 3.1 福尔马林诱导急性炎性痛对 SDH 中 Cav3 表达无明显影响。A：右后足背皮下注射生理盐水或福尔马林溶液后 60 min 内观察到的大鼠疼痛反应时间的比较；B：生理盐水与福尔马林注射后 SDH 中 c-Fos 蛋白（红色）表达阳性细胞的免疫组化染色代表图，标尺为 200 m；C：生理盐水组与福尔马林组大鼠 SDH 浅层（I-II）和深层（III-IV）c-Fos 阳性细胞计数的柱状图；D：生理盐水组与福尔马林组大鼠 SDH 注射侧 Cav3.1-3.3（绿色）的免疫组化染色代表图，标尺为 100 m；E：生理盐水组与福尔马林组 SDH Cav3.1-3.3 染色的相对平均荧光强度分析柱状图。各组 n = 6；* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001，福尔马林组与生理盐水组比较。为验证免疫组化染色抗体的特异性，我们进行了抗原预吸附实验，以检测SDH 中 Cav3.1-3.3 染色的特异性。如图 3.2 所示，图 B 为 Cav3.1-3.3 阳性对照染色图，可见 Cav3.1-3.3 在 SDH 均有明显染色（绿色）；而在图 A 的免疫预吸
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 户雪雪;彭慧浈;程小娥;冯小金;马龙先;蒋昌宇;柳涛;;米诺环素缓解大鼠炎性痛的脊髓机制[J];中华医学杂志;2017年32期
本文编号：2749147
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/shenjingyixue/2749147.html
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