IKBKE激酶抑制剂amlexanox通过影响Hippo通路抑制胶质母细胞瘤进展的研究

发布时间：2020-07-10 22:28

【摘要】：既往有很多的文献研究显示,IKBKE(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit epsilon)作为非经典IKK激酶的家族一员,其在炎症性及代谢性疾病中起着重要的作用。近来,IKBKE被认为是一种致瘤性的蛋白,其在许多肿瘤中出现高表达现象,沉默IKBKE表达后,肿瘤进展会受到抑制,因此IKBKE在肿瘤靶向治疗中成为一个非常具有潜力的新靶点。作为IKBKE的小分子抑制剂,amlexanox被报道具有抗炎、抗过敏、调节免疫功能等作用,已经在临床上应用其治疗口腔溃疡、过敏性哮喘和肥胖等疾病。在本论文中,我们展示了amlexanox具有抑制胶质母细胞瘤细胞生长、迁移和侵袭的作用,同时还可以诱导肿瘤细胞周期阻滞在G0/G1期以及诱导其发生细胞凋亡等作用。Amlexanox可以与IKBKE相结合,调节其激酶的活性,降低其蛋白表达水平。进一步的机制研究则表明,IKBKE与LATS1/2直接结合,沉默IKBKE可以改变Hippo通路核心蛋白LATS1/2蛋白表达量,从而激活Hippo通路,抑制胶质母细胞瘤发展。裸鼠体内实验结果进一步显示amlexanox可以有效的抑制裸鼠皮下肿瘤和颅内肿瘤的生长,延长裸鼠的生存时间。这些研究表明amlexanox在治疗胶质母细胞瘤中具有重要的应用价值。方法1.首先确定胶质瘤母细胞瘤细胞(U87和U251)在同一时间不同浓度和同一浓度不同时间下的存活率(CCK-8实验),计算其半数抑制浓度IC50,从而确定实验所需的浓度梯度;2.利用流式细胞仪技术检测amlexanox对肿瘤细胞周期及凋亡的影响;3.利用细胞克隆形成实验检测amlexanox对肿瘤细胞增殖的影响,利用Transwell实验检测amlexanox对肿瘤细胞迁移和侵袭的影响;4.利用蛋白免疫印迹的方法(western blot,WB)检测amlexanox对U87和U251细胞IKBKE和Hippo通路核心蛋白表达量的影响;5.利用WB检测沉默(shRNA)和过表达(重组质粒)IKBKE后,U87和U251细胞Hippo通路核心蛋白及下游靶蛋白表达量的变化;6.利用WB及免疫荧光技术(IF)检测沉默IKBKE后,U87和U251细胞Hippo通路核心蛋白胞浆和胞核内的变化;7.利用qRT-PCR检测沉默IKBKE后,LATS1/2在转录水平的变化;利用免疫共沉淀(Co-IP)和WB检测IKBKE与LATS1,IKBKE与LATS2是否存在内源性结合,沉默IKBKE后LATS2泛素化水平变化;8.建立裸鼠皮下肿瘤模型(U87细胞),腹腔内注射amlexanox(100mg/kg/day),监测肿瘤体积和裸鼠体重变化,处死裸鼠后,比较对照组和实验组肿瘤重量,免疫组化(IHC)检测IKBKE和Hippo通路核心蛋白及下游靶蛋白的变化;9.利用立体定向技术将转染了luciferase病毒的U87细胞注入裸鼠颅内,建立裸鼠颅内肿瘤模型,腹腔内注射amlexanox(100mg/kg/day),活体成像技术监测颅内肿瘤体积变化,记录裸鼠生存时间,IHC检测IKBKE和Hippo通路核心蛋白及下游靶蛋白的变化。结果1.Amlexanox可以抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖及集落形成;2.Amlexanox可以抑制胶质母细胞瘤细胞的迁移和侵袭能力;3.Amlexanox可以使胶质母细胞瘤细胞阻滞在G0/G1期,并且可以诱导其发生细胞凋亡;4.Amlexanox可以在转录后水平影响IKBKE蛋白表达,进而改变Hippo通路核心蛋白表达量及磷酸化状态;5.IKBKE可以直接与LATS1/2相结合,沉默IKBKE可以通过抑制LATS1/2泛素化和降解,从而激活了Hippo通路;6.经蛋白酶体抑制剂MG132处理后,IKBKE促进LATS1/2降解的过程受到抑制;7.Amlexanox可以有效抑制裸鼠皮下肿瘤的生长,且短期内对裸鼠的体重不会产生明显的影响,IHC检测发现Hippo通路核心蛋白YAP1及其下游靶蛋白Axl,c-Myc和Cyr61蛋白表达量减少,而LATS1/2和p-YAP(Ser127)蛋白表达量则升高;8.Amlexanox可以有效抑制裸鼠颅内肿瘤的生长,延长其生存时间,IHC检测发现Hippo通路核心蛋白YAP1及其下游靶蛋白Axl,c-Myc和Cyr61蛋白表达量减少,而LATS1/2和p-YAP(Ser127)蛋白表达量则升高;结论1.Amlexanox可以有效的抑制胶质母细胞瘤细胞的生长,降低了IKBKE蛋白表达,改变了Hippo通路核心蛋白表达量及磷酸化状态;2.IKBKE可以直接与LATS1/2相结合,沉默IKBKE抑制了LATS1/2泛素化及降解水平,从而激活了Hippo通路,抑制了胶质母细胞瘤的发展;3.Amlexanox可以有效的抑制裸鼠皮下肿瘤和颅内肿瘤的进展,而这主要是通过抑制IKBKE活性及表达量,激活Hippo通路实现的。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.4
【图文】：

生存率,胶质母细胞瘤,博士学位论文,大学

大学博士学位论文一、Amlexanox 通过激活 Hippo 通人胶质母细胞瘤进展的体外间不同浓度（6.25, 12.5, 25, 50, 100, 150, 200, 250 和 300μM）间（24, 48, 72，96h）条件下，处理 U87 和 U251 细胞。

克隆形成,细胞克隆,胶质母细胞瘤,孔细胞

天津医科大学博士学位论文一、Amlexanox 通过激活 Hippo 通路抑制人胶质母细胞瘤进展的体外研究率出现下降，且具有浓度依赖和时间依赖，尤其是在 72 小时的 IC50 条件下，肿瘤细胞生存率出现明显降低。Amlexanox 药物 72 小时的 IC50 在 U87 细胞为133.9±3.035μM，在 U251 细胞为 114.2±1.462μM。依据测得的 amlexanox 的IC50，我们选择 50、100 和 150μM 作为浓度梯度来进行后续的实验。1.3.2 Amlexanox 可以抑制胶质母细胞瘤细胞克隆形成能力为了研究 amlexanox 对胶质母细胞瘤细胞克隆形成能力的影响，我们将 U87和 U251 细胞接种到 6 孔细胞培养板中，每孔细胞为 2000 个，然后再用不同浓度的 amlexanox（0, 50，100 和 150μM）进行处理，2 周后将形成的细胞克隆集落进行染色并采图（图 2），获取实验数据进行分析（图 3）。

直方图,克隆形成,直方图,细胞周期阻滞

3 Amlexanox 抑制 U87 和 U251 细胞克隆形成的直方图（*P<0.05，**P<0.01，***P<从上图分析我们可以看出，amlexanox 可以抑制 U87 和 U251 细胞克隆形且具有浓度依赖性，在 72 小时 IC50 浓度下抑制作用较为明显。3.3 Amlexanox 可以诱导胶质母细胞瘤细胞周期阻滞细胞周期指细胞从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束的周期，反映增殖的速度。为了研究 amlexanox 对胶质母细胞瘤细胞周期的影响，我们浓度的 amlexanox（0, 50，100 和 150μ M）处理 U87 和 U251 细胞，72 用流式细胞仪检测其细胞周期变化（图 4），将所得数据进行分析和计算。在下图中我们可以看出，amlexanox 可以诱导 U87 和 U251 细胞周期阻滞/G1 期。DNA 复制所需要的蛋白质和 mRNA 的合成以及细胞体积增长都期完成的，说明 amlexanox 可以抑制 U87 和 U251 细胞周期相关蛋白和 mR

【相似文献】