光敏剂TCMePyP的制备及对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞杀伤作用的研究

发布时间：2020-07-13 17:15

【摘要】：目的:通过对H_2TPyP(5,10,15,20-4(4-pyridine)porphyrin)进行修饰,制备得到TCMePyP(5,10,15,20-Tetrakis-(N-carboxymethyl-4-pyridinium)p orphyrin tetrabromide),研究TCMePyP的物理化学性质和光动力作用下对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的杀伤作用及机理。研究Q[7]-TCMePyP及Q[7]-anch ored-PAA负载TCMePyP光动力作用下对SH-SY5Y细胞的杀伤作用。方法:合成TCMePyP,利用二维核磁谱图表征及研究其动态激光散射光谱。测定H_2TPy P及TCMePyP紫外-可见光吸收光谱和荧光光谱。使用SOSG(Singlet Oxygen S ensor Green)对其细胞外单线态氧进行检测。利用MTT比色法检测TCMePyP对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的生存率的影响。激光共聚焦显微镜下观察其细胞内定位,检测细胞内光动力过程中产生ROS的变化。应用流式细胞术检测TCM ePyP-PDT诱导细胞凋亡。通过划痕实验检测TCMePyP在光动力作用下SH-SY5Y细胞的迁移运动与修复能力。MTT比色法检测TCMePyP、Q[7]-TCMePyP及Q[7]-anchored PAA负载TCMePyP,光动力作用下SH-SY5Y细胞的生存率的影响。激光共聚焦显微镜下观测TCMePyP、Q[7]-TCMePyP及Q[7]-anchored PAA负载TCMePyP在SH-SY5Y细胞内荧光量的变化。结果:二维核磁谱图表征TC MePyP结构。动态激光散射光谱表明,TCMePyP溶液表现出单峰分布,水合动力学直径显著减小。10μmol/L TCMePyP的紫外-可见吸收明显增加,λ_(ex)=515nm时,TCMePyP荧光强度增大。525nm激光照射1×10~(-5) mol/L TCMePyP 11min时,单线态氧产生达最高。光照密度(10.48 mW/cm~2),光照时间1min-9min,525nm、660nm激光的细胞光毒性极低(P0.05);TCMePyP:2.5μmol/L-80μmol/L,SH-SY5Y细胞暗毒性极低(P0.05)。525nm激光照射10μmol/L、50μmol/L TCMePyP,细胞生存率受到明显抑制,10μmol/L TCMePyP,细胞杀伤效果更强,细胞生存率随光照时间呈下降趋势。通过倒置显微镜观察到,随光照时间延长,细胞形态明显改变,坏死细胞逐渐增多。光动力作用24小时后流式细胞术检测到,TCMePyP-PDT下细胞凋亡率明显增加(P0.01)。在激光共聚焦显微镜下观察到,TCMePyP定位于SH-SY5Y细胞的胞质,进行光照后,定位于细胞核。TCMePyP光照3min及5min时,激光共聚焦显微镜检测:ROS产生明显增多(P0.05)。划痕实验显示,TCMePyP-PDT明显抑制了SH-SY5Y细胞的迁移能力(P0.05)。浓度5μmol/L,TCMePyP、Q[7]-TCMePyP和Q[7]-P AA-TCMePyP随光照时间的延长,细胞生存率呈降低趋势,Q[7]-PAA-TCMePy P组杀伤更明显(P0.05)。525nm激光照射2min各浓度组Q[7]-PAA-TCMeP yP组较TCMePyP组及Q[7]-TCMePyP组而言,对SH-SY5Y细胞杀伤更明显(P0.05)。共聚焦显微镜下测定到5μmol/LQ[7]-TCMePyP及Q[7]-PAA-TCMePy P可使SH-SY5Y细胞内的荧光增强。结论:与H2TPyP比较,TCMePyP的水溶性明显改善,可见光区吸收增强,发射荧光更强。光照条件下单线态氧产率较高、光毒性、暗毒性低、细胞定位明确。光动力处理后SH-SY5Y细胞杀伤更明显。瓜环Q[7]及瓜环Q[7]-anchored PAA纳米颗粒负载新型水溶性卟啉化合物(TC MePyP)后,均能使细胞内产生的荧光强度增大,对SH-SY5Y细胞的杀伤作用增强,表明瓜环及瓜环聚合物纳米颗粒具有药物载体的特征。
【学位授予单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.4
【图文】：

路线图,路线,三氯甲烷,绿色产物

倒置荧光显微镜 Ts-2磁力搅拌器（85-2A）纳米粒度 Zeta 电位仪流式细胞仪（NovoCtye）日本尼康上海沪析公司英国马尔文公司中国杭州艾森生物公司1.2 方法1.2.1 TCMePyP 的制备及表征1.2.1.1 5，10，15，20-四(4-吡啶基)卟啉盐酸盐 (H2TPyPH)的制备将 H2TPyP（123.7mg，约 0.2mmol）置于 50mL 圆底烧瓶中，加入约 8mL三氯甲烷使其完全溶解，缓慢加入 HCl（1mol）约 3mL，溶液中出现绿色沉淀，待反应完全，减压过滤，滤饼用三氯甲烷（20mL）洗涤两次，之后用丙酮（20mL）洗涤两次，得绿色产物。得到固体产物 93mg，产率为 60.86%。1.2.1.2 TCMePyP 的制备

细胞,位置,细胞悬液,布板

外细胞不予计数，若细胞压在格上，按数上不数中细胞相加，除以 4，乘以 10000，所得细胞个SH-SY5Y 细胞悬液长期细胞，PBS 液 3mL 洗涤细胞两次，排尽，加内静置 2min，倒置显微镜下观察到细胞梭型变液，终止胰酶消化，巴氏吸管反复吹吸细胞及移入 15mL 离心管中，1500rpm，离心 5min，去4mL，反复吹吸，见细胞团块消失，细胞悬液制Y5Y 细胞布板动力治疗过程中，激光照射对临近孔的干扰，采临孔不接种细胞。将对数生长期 2×104个/孔细入 PBS 液，5%CO2恒温培养箱中培养 24h，倒板底部，进行后续实验。

谱图,核磁谱,溶于,浓度

2 结果2.1 核磁谱图解析从图 2-1 中可以得到1HHMR（400MHz，DMSOd6，25℃）：δ 9.47（d，8H，J=8Hz），δ9.16（s，8H），δ 9.98（d，8H，J = 8Hz），δ 4.70（s，8H），-3.12（s，2H）。在卟啉骨架中，吡啶环上的 H 以及吡咯上的 H 由于分子的共轭效应，化学位移应位于低场，所以 δ 4.70 处的 H 应归属于吡啶 N 上的亚甲基，且低场处的两组二重峰应归属于卟啉骨架吡啶环上的 H，即 δ 9.47 和 δ 8.98。通过g-COSY 与ROSY NMR二维核磁谱图对卟啉骨架吡啶环上的H进行归属，如 ROSY 图所示，图中 δ 4.70 的 H 与 δ 9.47 的 H 相关联，而在 g-COSY 谱图中并没有相关联，说明吡啶 N 上的亚甲基的 H 距离 δ 9.47 的 H 在空间上更靠近，所以 δ 9.47 的 H 归属于卟啉骨架吡啶环上的 Hα，则 δ 8.98 归属于卟啉骨架吡啶环上的 Hβ。

【参考文献】