bFGF调控IL-6表达的机制及bFGF-siRNA增强胶质瘤化疗敏感性的研究

发布时间：2017-03-29 21:19

  本文关键词：bFGF调控IL-6表达的机制及bFGF-siRNA增强胶质瘤化疗敏感性的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景:多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)是常见的中枢神经系统肿瘤,它的特点是高致残率和致死率。由于胶质瘤在颅内脑组织中呈浸润、侵袭生长的特性,手术很难完全将其切除,加上胶质瘤细胞异常的增殖能力,常常是复发的根源。此外,由于错综复杂的肿瘤微环境能够营造适应胶质瘤细胞生长的温床,使其对放化疗产生一种抵抗能力。由于这种特性的存在,手术加上放、化疗并不能彻底清除残余胶质瘤细胞,从而导致胶质瘤的复发,使治疗失败,这是胶质瘤患者治疗失败的主要原因。随着各项生物技术研究水平的提高,与胶质瘤密切相关的分子及其作用机制逐渐得到深入的研究,并且生产了许多针对特定分子的药物来进行治疗的手段。此外,新发现的生物标记物对于临床肿瘤的恶性程度分级以及预后有重要价值,并且为我们的研究提供了很好的方向。因此,我们针对胶质瘤特定分子标记物进行研究,希望能够提供新的治疗方案,从而指导临床治疗。目的:肿瘤微环境犹如肥沃的土壤,肿瘤细胞相当于种子,这种特定的微环境的存在导致肿瘤细胞的生成、繁殖、迁移以及血管生成能力较正常组织更为活跃。结合本课题组前期发现,b FGF作为胶质瘤中高表达的细胞因子,对胶质瘤细胞生存的微环境的维持有重要作用。此外,我们发现b FGF与胶质瘤恶性程度相关的另一重要的细胞因子IL-6存在相互调控的关系。二者对于胶质瘤恶性程度的维持有重要作用,并且存在相互调控的关系,因此,我们试图通过破坏胶质瘤细胞生存的微环境能够削弱对化疗药物的抵抗能力。方法:我们将此研究分为两部分:第一部分:重点研究在胶质瘤微环境中,外分泌的b FGF调控IL-6的表达机制。利用b FGF-si RNA技术沉默胶质瘤细胞b FGF的表达,另外一组加入重组人b FGF刺激胶质瘤细胞后,检测两种干扰因素对IL-6的m RNA表达水平以及蛋白水平的改变,确定b FGF对IL-6的表达存在调控关系。进一步,为明确b FGF通过何种机制调控IL-6的表达,我们加入重组人b FGF之后,检测MAPK(ERK1/2、p38、JNK)信号通路的磷酸化水平改变情况,确定b FGF的下游调控机制。此外,进一步检测IL-6相关的转录因子(AP-1、CREB、C/EBPβ)磷酸化水平以及是否NF-κB进入细胞核的情况。最后,我们预先利用特异性阻断剂分别阻断ERK1/2、p38、JNK信号通路,然后给予b FGF刺激,检测下游IL-6的转录因子的活化水平。根据实验结果确定上下游关系,总结归纳出胶质瘤微环境中b FGF调控IL-6表达的具体机制。第二部分:沉默b FGF的表达对增强替莫唑胺对胶质瘤化疗敏感性的研究。首先利用b FGF-si RNA下调胶质瘤细胞中b FGF的表达,从而改变肿瘤微环境中的b FGF含量。转染小干扰RNA的24小时后给予替莫唑胺治疗,继续化疗48小时治疗结束。然后,通过MTT实验检测到联合治疗组的胶质瘤细胞增殖受到抑制情况最显著;其次,通过流式细胞仪检测到联合组的细胞凋亡明显增加,并且细胞周期在G0/G1期收到阻滞;然后,通过Transwell实验检测到治疗后联合组的胶质瘤细胞的迁移能力明显受到抑制;最后,经Western Blot检测凋亡和迁移相关蛋白的表达,发现抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平降低,而拮抗Bcl-2的蛋白Bax表达水平上调,迁移相关蛋白MMP-2、MMP-9的表达水平的降低。结果:第一部分1、转染b FGF-si RNA后,IL-6的m RNA的表达水平降低。给予b FGF刺激后IL-6的m RNA表达水平增加。2、转染b FGF-si RNA后,IL-6的蛋白表达水平降低,给予b FGF刺激后IL-6的蛋白表达水平增加。3、给予b FGF刺激后,MAPK信号通路活化水平增强,IL-6转录因子的活化增强。4、阻断ERK1/2、JNK信号通路后,转录因子AP-1的磷酸化水平降低。阻断p-38信号通路后,NF-κB的磷酸化水平降低。5、分别阻断ERK1/2、p38、JNK通路,胶质瘤细胞的IL-6蛋白表达水平明显降低。第二部分1、联合应用b FGF-si RNA能够增强替莫唑胺对胶质瘤细胞增殖的抑制作用。2、联合应用b FGF-si RNA能够增强替莫唑胺对胶质瘤细胞凋亡的促进作用。3、联合应用b FGF-si RNA和替莫唑胺能够导致胶质瘤细胞周期G0/G1期阻滞。4、联合应用b FGF-si RNA能够增强替莫唑胺对胶质瘤细胞的迁移的抑制作用。5、b FGF-si RNA能够增强替莫唑胺对胶质瘤细胞毒性的作用机制可能与MAPK信号通路相关。结论:1.b FGF通过MAPK信号通路介导NF-κB和AP-1的磷酸化,进而调控IL-6的表达。2.沉默b FGF的表达能够增强替莫唑胺对胶质瘤细胞的化疗敏感性。
【关键词】：胶质母细胞瘤碱性成纤维细胞因子(bFGF)IL-6 替莫唑胺联合化疗
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 缩略语/符号说明12-13
• 前言13-15
• 研究现状、成果13
• 研究目的、方法13-15
• 一、胶质瘤微环境中bFGF调控IL-6 表达机制的研究15-39
• 1.1 材料15-17
• 1.1.1 主要试剂15-17
• 1.1.2 主要仪器设备17
• 1.2 实验方法17-27
• 1.2.1 细胞培养17-19
• 1.2.2 利用小干扰RNA转染细胞以及重组bFGF刺激细胞19-20
• 1.2.3 通过RT-PCR实验检测IL-6 mRNA表达水平的改变20-22
• 1.2.4 通过ELISA实验检测细胞培养上清液中IL-6 蛋白的表达量22-23
• 1.2.5 通过Western blotting实验检测酸目的蛋白的磷化水平23-26
• 1.2.6 免疫荧光检测NF-κB进入细胞核的情况26-27
• 1.2.7 统计学分析27
• 1.3 结果27-34
• 1.4 讨论34-38
• 1.5 小结38-39
• 二、bFGF-siRNA促进胶质瘤细胞化疗敏感性的研究39-55
• 2.1 材料39-41
• 2.1.1 主要试剂39-41
• 2.1.2 主要仪器设备41
• 2.2 实验方法41-45
• 2.2.1 细胞培养41
• 2.2.2 细胞转染及药物治疗41-42
• 2.2.3 MTT实验检测细胞增殖42
• 2.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡42-43
• 2.2.5 流式细胞术检测细胞周期43-44
• 2.2.6 Transwell实验检测细胞迁移能力44-45
• 2.2.7 Western blot法检测相关蛋白的表达水平及磷酸化水平的改变45
• 2.2.8 统计学分析45
• 2.3 结果45-51
• 2.3.1 联合化疗对胶质瘤细胞增殖的抑制45-46
• 2.3.2 联合化疗对胶质瘤细胞凋亡的影响46-48
• 2.3.3 联合化疗对胶质瘤细胞周期的影响48
• 2.3.4 联合化疗对胶质瘤细胞迁移能力的影响48-49
• 2.3.5 检测凋亡、迁移相关蛋白的表达水平的改变49-50
• 2.3.6 MAPK信号通路磷酸化水平的改变50-51
• 2.4 讨论51-53
• 2.5 小结53-55
• 结论55-56
• 参考文献56-64
• 发表论文和参加科研情况说明64-65
• 综述 胶质瘤耐药性相关分子机制的研究进展65-72
• 综述参考文献69-72
• 致谢72-74
• 个人简历74

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 王淑杰;王金环;张益伟;徐新女;刘宏胜;;碱性成纤维细胞生长因子小分子干扰RNA对胶质瘤细胞株U251增殖与凋亡的影响[J];癌症;2008年09期

2 ;MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells[J];Cell Research;2002年01期

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本文编号：275462