microRNA-134在围术期缺血性脑卒中的作用及其分子机制研究

发布时间：2017-03-29 22:04

  本文关键词：microRNA-134在围术期缺血性脑卒中的作用及其分子机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:探讨microRNA-134(miR-134)在围术期缺血性脑卒中的作用及其可能的分子机制。方法:本实验利用培养的乳鼠原代细胞氧-糖剥夺(OGD)模拟离体细胞缺血模型和小鼠脑中动脉阻塞(MCAO)致缺血性脑卒中整体动物模型,借助生物化学、分子生物学、神经行为学和形态学等学科研究技术进行研究。1.研究缺血后不同时间点小鼠脑组织和离体培养神经元内miR-134表达量的变化和神经元损伤情况。在细胞水平上,采用1h OGD方法制作细胞缺血损伤模型,实验分组包括正常组(Normal)和氧-糖缺失组(1h OGD/reoxygenation),后者包括复糖复氧后12h、1d、3d、7d四组。在动物水平上,采用1h脑中动脉阻塞(1h MCAO)致缺血性脑卒中,实验分组包括:正常组(Normal)、假手术组(Sham)和MCAO再灌组(1h MCAO/reperfusion),MCAO再灌组又包括再灌12h、1d、3d、7d四组。首先使用实时定量RT-PCR技术,检测原代培养脑皮层神经元在1h OGD后不同复糖复氧时间和小鼠1h MCAO后不同再灌时间miR-134表达量的变化;利用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测神经元生存率,尼氏染色检测鼠脑神经元的缺失情况;利用Western blotting检测神经元内Caspase-3活化水平即cleaved-caspase-3蛋白的表达水平以反映细胞凋亡情况。2.研究miR-134对缺血性脑损伤的作用及其机制。(1)在细胞水平上,采用1h OGD/24h reoxygenation方法制作细胞缺血损伤模型,实验分组包括:正常组(Normaxia)和模型组(1h OGD/reoxygenation),后者又分为非转染组(Non-trans)、miR对照组(miR Ctrl)、miR-134前体组(Pre-miR-134)和miR-134抑制剂组(pre-mir-134inhibitor)。首先利用实时定量rt-pcr技术,检测原代培养脑皮层神经元转染病毒载体后mir-134的表达情况,然后用mtt检测不同转染组1hogd/24hreoxygenation后原代培养脑皮层神经元缺血损伤的情况;使用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(tunel)方法和检测caspase-3活化水平,观察mir-134对ogd致原代培养脑皮层神经元凋亡的影响;通过双荧光素酶报告基因实验,检测mir-134和其预测靶基因mrna的3?-utr序列是否存在直接作用位点,选出直接作用的靶基因;使用蛋白免疫印迹(westernblot)方法进一步验证过表达或抑制mir-134对hspa12b蛋白的调节作用;最后,共转染hspa12bsirna利用mtt法和westernblot法进一步检测mir-134在原代细胞缺血性损伤中的作用及是否直接对hspa12b蛋白的有调控作用。(2)在动物水平上,利用1hmcao/24hreperfusion模型模拟缺血性脑卒中,实验分组包括:假手术组(sham)、mcao再灌组、脑皮质注射携带mir-134抑制剂慢病毒载体mcao再灌(mcao+pre-mir-134inhibitor)及其对照组。应用实时定量rt-pcr技术,观察脑皮质注射病毒载体后mir-134的表达情况;运用神经行为学评分、nissl染色和ttc染色等方法,评价mir-134对小鼠脑缺血再灌注损伤程度的影响;应用蛋白免疫印迹方法,检测缺血小鼠脑组织mir-134对其预测靶基因hspa12b蛋白表达的影响。结果:1.原代培养脑皮层神经元1hogd后,与正常组相比,复糖复氧12h-7d过程中mir-134的表达水平明显升高,细胞存活率明显降低,在1d时最明显。与正常组相比,在动物1hmcao再灌1d时mir-134的表达水平最高,之后逐渐降低;神经细胞缺失最重,之后缺失情况减轻;caspase-3活化水平最高,之后表达量也逐渐降低;假手术组mir-134表达量及神经元损伤情况差异均无统计学意义。2.(1)与正常组比较,在ogd致神经元缺血损伤中mir-134前体组,mir-134的表达水平明显提高,细胞存活率明显降低,hspa12b蛋白水平明显降低,荧光素酶活性也明显降低;而mir-134抑制剂组mir-134的表达水平明显降低,细胞存活率显著提高,hspa12b蛋白水平明显提高,荧光素酶活性也明显升高;但各组之间hspa12bmrna水平差异无统计学意义。hspa5荧光素酶活性水平差异无统计学意义。共转染hspa12bsirna之后,hspa12b蛋白表达量明显降低,细胞存活率较单转染mir-134前体更低,神经元中裂解的caspase-3(激活)的水平也明显增高。(2)与mcao组比较,mir-134抑制剂组神经行为学评分降低,小鼠脑梗死体积明显减小,皮层神经细胞的损伤降低,而且缺血性脑卒中小鼠脑内cl-caspase-3表达水平也明显减低低;相反,miRNA-134的靶蛋白HSPA12B的表达水平明显升高。结论:miR-134通过负性调控HSPA12B蛋白表达水平,在OGD和MCAO致神经元缺血性损伤中发挥重要作用,为围术期缺血性脑损伤早期防治及预后提供实验依据、有效的生物分子标记物和新的治疗靶点,同时进一步丰富人们对脑缺血/低氧性损伤机制的认识。
【关键词】：缺血性脑卒中 miR-134 热休克蛋白A12B 氧-糖剥夺(OGD) 大脑中动脉阻塞(MCAO)
【学位授予单位】：潍坊医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R743.3
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 符号说明10-11
• 前言11-14
• 材料与方法14-29
• 结果29-33
• 讨论33-36
• 结论36-37
• 附图表37-47
• 参考文献47-51
• 文献综述 miRNA和HSP70在缺血性脑卒中的作用及研究进展51-63
• 参考文献59-63
• 致谢63-64
• 攻读学位期间撰写的论文64

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本文编号：275505