Hsp27MP对实验性脑梗死及罗氟司特对SAH后EBI保护作用机制研究
发布时间：2020-07-17 23:23
【摘要】：研究背景卒中被认为是世界各国主要的公共卫生问题之一,占据发达国家健康支出费用第三位,为成人常见的致死、致残原因,每16例死亡病人中就有1例死于中风。在所有卒中事件大部分为缺血性卒中,出血性卒中仅占15%左右。目前,我国流行病学统计数据表明,每年死于急性缺血性脑卒中的人数已经超过肿瘤和心血管疾病,跃居第1位,成为首位国民致死原因,且仍以每年9%的速率增长。即使存活下来,仍需要长期昂贵的康复治疗。脑卒中存活者约3/4丧失劳动能力,其中重度致残者约占40%,导致极大的社会和经济负担。目前,循证医学已证实早期溶栓及介入治疗的有效性,但由于其狭窄的治疗时间窗、昂贵的费用及较高技术水平,由于狭窄的治疗窗,仅一小部分患者从静脉溶栓后血运重建获益。迄今为止,临床尚缺乏有效的脑梗死后脑保护治疗策略。脑梗死病理生理机制复杂,脑梗死后多种因素导致细胞死亡信号通路启动,因此靶向脑缺血后细胞死亡通路的激活进行了多种研究,靶向信号转导通路,进行神经保护药物的研发,虽然动物实验取得了可喜的成绩,然而临床实验未取得成功。考虑到许多针对单一信号转导通路为靶点的候选药物研究的失败,对缺血性脑损伤神经保护的首选策略可能是同时阻断神经损伤的多个核心的关键途径,包括与脑缺血病理过程有关的多细胞复杂活动和事件。同时阻断脑损伤多个关键途径是缺血性脑卒中的首选治疗策略。细胞死亡信号和炎性反应在脑缺血损伤中起重要作用。热休克蛋白家族包含一组热敏细胞应激蛋白,它们最好的特征在于分子伴侣功能,尤其是伴随热应激。在过去的几十年的研究中,热休克蛋白一直是研究的焦点。根据热休克蛋白分子量、域保护和功能分为多个亚家族。小热休克蛋白(sHSP),包括HSP27,广泛表达于多种物种,单体分子量在15-42kDa之间。最近的实验研究开始强调Hsp27在细胞应激压力中保护作用重要性。越来越多的证据表明Hsp27抑制细胞死亡信号,另外,Hsp27经过转录后修饰,导致不同的控制功能。HSP27差异表达表达于某些神经元的亚型,其中高组成型表达主要限于脊髓神经节中和脑干,基础表达在小脑浦肯野纤维细胞的亚型。无论是作为组成型表达还是被诱导应对细胞应激,Hsp27在神经元损伤时表达。已有充分的实验证据表明,Hsp27具有在多种神经疾病模型减少的神经元损伤的功效,在神经保护中扮演重要能动角色。虽然Hsp27在脑中的组成型表达水平较低,但在中枢神经系统若干应激,如包括热应激,局部缺血和癫痫发作可诱导Hsp27的表达。免疫组化表明,Hsp27在神经胶质细胞中表达量较多,仅在有限数量的神经元细胞中表达。有研究报道,Hsp27经单纯疱疹病毒载体递送到脑可以有效预防红藻氨酸盐诱导的海马神经元凋亡。过表达人类Hsp27可以有效降低红藻氨酸诱导转基因小鼠的海马神经元凋亡。脑缺血后,内源性Hsp27表达增加主要在胶质细胞。病毒转导或基因过表达Hsp27显著减少缺血性病变的面积。全长蛋白转导HSP27能够有效地降低沙鼠全脑缺血模型海马CA1区损伤。凋亡信号调节激酶1(ASK-1)是传导细胞死亡信号的关键分子且在小胶质细胞激活中起关键作用。许多研究发现Hsp27可直接抑制ASK1通过阻断死亡信号而对脑缺血发挥保护作用。由于血脑屏障的存在,大分子蛋白药物不易透过血脑屏障,且具有免疫原性,大大限制了其应用。多肽类药物近年来成为医药界研究的热点,已经多种肽类药物广泛应用于肿瘤、炎症、心血管疾病、中枢神经系统疾病和免疫性疾病等。由于多肽类药物具有整个蛋白的生物学功能,分子量小,易于人工合成,副作用低,因而更具有临床研发价值。多肽类药物研发的迅猛发展引起神经科学工作者的重视,积极研发靶向中枢缺血性神经损伤的保护多肽类药物,已经取得了一定的进展。依照国际药学界划分标准,蛋白质类药物:由大于100个氨基酸分子组成的药物,如临床常用药物胰岛素、干扰素等;多肽类药物:100个以下的氨基酸组成的药品,目前临床应用的多肽药物共有80余种,涉及内分泌、血管、肿瘤、泌尿、免疫等多个系统疾病的治疗。与全长蛋白及化学药物相比,短肽类药物具有以下优势:(1)短肽的免疫原性更弱,潜在的副作用也就更少;(2)短肽具有更高的生物活性和特异性;(3)易于容易合成和提纯;(4)在体内具有较好的亲和性,且药物相互作用比较少。关于Hsp27模拟肽(HSP27MP)对脑梗死的保护作用尚未见相关研究报导。研究目的1.观察HSP27MP静脉给药后,正常生理状态及实验性脑梗死,其在神经元,小胶质细胞,ASK1分子内的分布。2.探讨HSP27MP对实验性脑梗死的保护作用。3.研究HSP27MP对实验性脑梗死的保护作用机制。研究方法1.实验动物SPF级雄性昆明种小鼠,体重25-35g,购至山东省动物实验动物中心,动物许可证号:SCXK(京)2012-0001。实验动物操作遵照泰山医学院生命科学研究中心脑科研究所《实验动物使用和管理原则》。2.制作小鼠实验性脑梗死模型局灶性皮质缺血小鼠模型采用光化学法诱导皮质微血管栓塞。小鼠采取5%异氟烷诱导麻醉,并以2%异氟烷维持麻醉。在手术过程中用恒温毯保持直肠温度在(37±0.5)。℃。经股静脉注入2%玫瑰红(100mg/kg体重),给药组注射玫瑰红的同时,给予HSP27MP(或HSP27MP-FITC)(10mg/kg体重),注射过程不少于2分钟。注射完毕后,即刻将小鼠固定于立体定位仪,调整定位仪参数,前囱和后囱处于水平位置。常规手术区消毒备皮。经颅顶正中线切开皮肤,长约1cm,钝性分离皮下组织,彻底去除骨膜,充分暴露前囟、后囟、人字缝和矢状缝。根据小鼠立体定向坐标图谱,选取小鼠感觉运动皮层为光照区域,具体参数为:矢状缝左侧2mm、前囟2.4mm,冠状缝后2mm。光源被放置尽可能贴近头骨,使冷光源光导纤维探头垂直贴近颅骨约1.5mm,经完整露骨照射4分钟。3.HSP27MP-FITC 脑内示踪HSP27MP-FITC给药后24h,取材后冰冻切片,行NeuN、Iba-1和ASK-1免疫荧光染色,评估HSP27MP在脑内的分布。4.局部脑血流量(regional cerebral blood flow,rCBF)测定于术后Oh和24h,麻醉小鼠后,剪开头皮,充分暴露头骨,采用2D多普勒激光血流测量仪检测各组小鼠的rCBF。5.神经功能评分24h后,取各组小鼠行Zealonga评分、平衡木实验(beam balance test)、圆筒实验(cylindertest)和足失误实验(foot-faulttest),评估神经功能。6.TTC染色测定脑梗死体积于术后24h过量麻醉处死小鼠,取新鲜脑组织切片,置于1%的TTC溶液中染色,扫描仪扫描后,应用ImageJ软件测量脑梗死体积。7.伊文思蓝(Evans Blue,EB)渗透法检测血脑屏障(blood brain barrier,BBB)通透性术后23h,经股静脉注射2%EB(5ml/kg weight),循环1h后,经心脏灌注50ml PBS后断头取脑,定性、定量评估BBB的通透性。干湿重法评估脑水肿。8.免疫荧光染色评估缺血半暗带小胶质细胞和激活的小胶质细胞取材后,脑冰冻切片,行Iba-1和CD-68染色,评估小胶质细胞及激活的小胶质细胞的表达数量程度。9.免疫荧光染色评估神经元凋亡取材后,脑冰冻切片,行NeuN+TUNEL免疫荧光染色,评估缺血半暗带神经元细胞凋亡。10.Western blot检测脑梗死后缺血半暗带ASK1和p-ASK1表达水平。研究结果:1.HSP27MP脑内分布FITC标记的HSP27MP静脉给药24h后,采用激光共聚焦显微镜及荧光显微镜观察HSP27MP在脑内的分布。研究结果发现,在生理及实验性脑梗死状态下,HSP27MP均可穿过BBB,在脑内弥漫性分布,可进入神经元和小胶质细胞,并可与靶分子ASK1共定位,且在脑梗死侧聚集。2.HSP27MP对实验性脑梗死的保护作用我们研究结果发现,HSP27MP可以有效降低脑梗死体积,改善脑梗死后早期神经功能缺损,但未能改善rCBF。证实了 HSP27MP对实验性脑梗死的保护作用。3.HSP27MP对实验性脑梗死的保护作用机制我们采用EB渗透法检测定性、定量检测BBB的通透性,干湿重法评估脑水肿,研究结果发现,HSP27MP可以有效保护脑梗死导致的BBB的破坏,减轻脑水肿。免疫荧光检测结果表明,HSP27MP减少小胶质细胞的激活,降低缺血半暗带区神经元凋亡。结论:1.HSP27MP静脉给药可以透过BBB进入中枢神经系统。2.HSP27MP对实验性脑梗死起到保护作用。3.HSP27MP通过保护BBB,减轻脑水肿,抑制小胶质细胞的激活,减少神经元的凋亡对实验性脑梗死起到保护作用。研究背景蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)主要是由颅内动脉瘤破裂所致的急性脑血管事件,约占所有脑卒中的5%-10%,在所有SAH患者中,猝死率高达20%,约50%的幸存者遗留认知障碍和慢性神经功能衰退[1]。SAH及其并发症是世界范围内成人致死致残的主要原因之一[2]。尽管SAH的诊断和手术治疗技术不断进展,但有效的干预治疗措施仍然有限,难以取得满意的临床效果。发现在过去的几十年里,脑血管痉挛(cerebralvasospasm,CVS)和动脉瘤再出血被认为预后不良的主要决定因素,虽然众多动物实验研究发现许多药物可以灭活致痉挛物质或者阻断动脉平滑肌收缩,但没有发现任何一种药物可以极大改善SAH患者的临床结局[3]。Kusaka[4]等2004年报导SAH后早期脑损伤(early brain injury,EBI),定义为出血即刻至CVS的开始这一阶段,指的是SAH后72h内整个脑的急性损伤,包括氧化应激,神经炎症,离子干扰和神经炎症等。其详细机制仍未阐明,潜在的病理生理机制主要包括早期颅内压的升高,脑血流减少,脑含氧量的降低,脑灌注压降低,神经元凋亡,血脑屏障的破坏和脑水肿等[5]。众多国内外神经科学者们研究发现是SAH后死亡和致残的主要原因[6],现在EBI被认为对SAH患者治疗改进具有巨大潜力,可减弱一些长期的SAH后二次致命性脑损伤。因此,寻求SAH后EBI的治疗新策略是神经科学界亟待解决的一个难题。新近的众多研究表明,许多炎症成分导致动脉瘤破裂后脑损伤的进展,而小胶质细胞是中枢神经系统具有免疫活性的原位吞噬细胞,在神经炎症中发挥着至关重要的作用[7]。与小胶质细胞类似,星形胶质细胞能合成和分泌炎症因子,如细胞因子和趋化因子。现有的文献表明,多种因素都与炎症病变的发展相关,SAH后,蛛网膜下腔的血红蛋白刺激白细胞和神经胶质细胞增殖,分泌的细胞因子导致脑损伤[8]。越来越多的研究证据表明神经炎症在EBI的发病机理中扮演重要角色,SAH后炎性因子的水平升高,参与了EBI的发生和发展[9,10],众多研究结果凸显了炎症反应是EBI的主要因素[11,12]。因此,寻求安全有效的抗炎药物是改善SAH患者预后的潜在治疗策略[13]。自19世纪70年代以来,磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)抑制剂一直是抗炎治疗药物的研究目标[14]。在许多免疫细胞中,PDE-4是第二信cAMP主要的降解酶,在大脑皮层和海马均有表达。抑制PDE-4在炎症扮演重要角色的神经系统疾病和损伤的动物模型中产生有益作用,如脊髓损伤[15]、创伤性脑损伤[16]、阿尔茨海默病[17]、重度抑郁症[18]、多发性硬化症[19]和缺血性脑卒中[20]。神经科学家通过实验研究发现,西洛地唑,选择性PDE3抑制剂,动物实验研究发现可以减轻SAH后CVS[21]。令人鼓舞的是,一项临床系统回顾和荟萃分析表明,西洛他唑可以显著减少动脉瘤性SAH患者的症状性脑血管痉挛,严重的脑血管痉挛,脑血管痉挛相关的脑梗死和不良后果的发生率,且无显著的不良反应,支持应用到动脉瘤性SAH[22]。体外实验研究证明,罗氟司特氮氧化物抑制多种细胞中的PDE-4,包括中性粒细胞,内皮细胞,单核细胞/巨噬细胞,Cd4+和CD8+T细胞,平滑肌细胞[23]。体内实验研究证明罗氟司特可以减轻烟草烟雾诱导的肺部炎症,肺血管重构和高血压[23]。罗氟司特具有脑渗透性,其在大脑中的浓度呈现剂量依赖性的方式增加[24,25],其非呕吐剂量可以有效改善高血压导致的啮齿类动物学习、记忆和认知功能损害。本研究测试的假设罗氟司特减少大鼠SAH后促炎细胞因子、血脑屏障通透性和神经细胞凋亡。研究目的1.研究罗氟司特对SAH后EBI是否有保护作用。2.研究罗氟司特对SAH后神经炎症的影响。3.探讨罗氟司特对SAH早期CVS的影响。研究方法1.实验动物12周龄雄性SPF级SD大鼠(体重250-350g)购自山东省实验动物中心,饲养于泰山医学院脑科研究所动物房,昼夜节律,自由饮食进水,符合山东省泰山医学院生命科学研究中心实验动物管理规定。饲养一周后进行实验,随机分为Sham组,SAH组和SAH+罗氟司特组。2.SAH模型制作和给药根据既往研究方法[26],采用改良的枕大池一次注射自体血法制作SAH大鼠模型。水合氯醛(400 mg/kg BW)经腹腔注射麻醉大鼠后,头低位30°固定于脑立体定位仪。剪开头部皮肤暴露环枕膜,采用微量注射泵向枕大池匀速注射自体非肝素化动脉血(0.1ml/100g BW),3min内注射完毕。注血完毕后滞留10min,缝合包扎。手术过程中采用恒温毯维持大鼠肛温在37±1℃。3.神经功能评分SAH后48h、72h对三组大鼠神经行为学(食欲、运动和神经功能缺损)评分[26]。4.脑组织含水量测定和血脑屏障通透性变化SAH后48h、72h,采用干湿重法测定三组大鼠的脑组织含水量,伊文思蓝外渗法评估血脑屏障通透性变化。5.免疫荧光染色观察大脑皮层IL-1β、IL-6、TNF-α的表达SAH后48h、72h,取脑制作冰冻切片,免疫荧光染色,在荧光显微镜下观察大脑皮层炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的变化。6.ELISA检测脑组织及外周血液中IL-1β、IL-6、TNFα的含量SAH后48h、72h,取脑组织匀浆,外周血离心,应用ELISA试剂盒检测炎性因子IL-1β、IL-6、TNFα的变化。7.免疫荧光染色观察大脑皮层小胶质细胞的表达SAH后72h,取脑制作冰冻切片切片,免疫荧光染色,观察大脑皮层小胶质细胞的表达情况。8.皮层神经元凋亡SAH后48h、72h,取脑制作冰冻切片,行皮层神经元actived caspase3和TUNEL免疫荧光染色,观察神经元凋亡的情况。9.基底动脉HE染色SAH后72h,取脑制作石蜡切片,HE染色观察基底动脉形态,用图像分析仪测定管腔横截面积。10.统计学分析实验所获取的数据均采用均以均数±标准差(x±s)表示,Sham组、SAH组和SAH+罗氟司特组之间比较采取the GraphPad Software Prism6.0软件行双因素方差分析(two-way analysis of variance,ANOVA),P0.05 表征显著统计学差异。研究结果1.罗氟司特可以改善SAH后神经功能缺损SAH后48h、72h,采用三种行为学检测评估罗氟司特可能神经保护作用。评分结果统计分析表明,与Sham组相比,SAH组神经功能评分显著增加;与SAH组相比,罗氟司特治疗组的神经功能评分显著降低。2.罗氟司特抑制SAH后血脑屏障通透性和脑水肿SAH后48h、72h,检测罗氟司特对血脑屏障通透性和脑水肿的影响。SAH组的伊文思蓝染料外渗量和脑含水量在高于在Sham组。而罗氟司特治疗后,SAH诱导的血脑屏障通透性的增加和减少脑水肿显著降低。3.罗氟司特降低SAH后IL-1β、IL-6和TNFα表达水平SAH后48h、72h,评价罗氟司特对IL-1β、IL-6和TNFα表达水平的影响。使用荧光显微镜观察免疫荧光染色结果,统计结果显示与Sham组相比较,SAH组IL-1β、IL-6和TNFα阳性细胞数明显增加。与SAH组比较,罗氟司特给药后,IL-1β、IL-6和TNFα阳性细胞显著地减少。ELISA检测结果显示,与Sham组相比,SAH组血清或皮质中的IL-1β、IL-6和TNFα含量明显增加,罗氟司特治疗后显著降低了 IL-1β、IL-6和TNFα的含量。4.罗氟司特降低SAH后小胶质细胞表达SAH后72h,免疫荧光染色结果显示,与Sham组相比较,SAH组小胶质阳性细胞数明显增加。然而,罗氟司特治疗组小胶质细胞阳性细胞数显著降低。5.罗氟司特抑制SAH后神经元凋亡在SAH诱导后48h和72h,采用active caspase-3/NeuN免疫荧光染色和TUNEL/DAPI染色量化了神经元细胞凋亡。统计结果表明与sham组相比,SAH组active caspase-3阳性细胞明显增加。然而与SAH组相比,罗氟司特治疗组active caspase-3阳性细胞显著减少。与SAH组相比较,罗氟司特治疗组TUNEL阳性细胞明显减少。6.罗氟司特减弱SAH后早期CVSSAH后72h,HE染色结果显示,与Sham组相比较,SAH组基底动脉痉挛明显,管腔面积减少。然而,罗氟司特治疗组基底动脉痉挛得到明显改善。结论罗氟司特显著改善大鼠实验性SAH后神经缺损,降低血脑屏障的渗透性,减弱小胶质细胞以及促炎的细胞因子IL-1β、IL-6和TNFα的表达,抑制神经细胞凋亡,减轻了 SAH后早期CVS。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R743.3
【图文】：
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本文编号：2760066
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R743.3
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本文编号：2760066
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