Per2基因过表达对U87胶质瘤干细胞放疗敏感性影响的研究

发布时间：2020-07-18 15:42

【摘要】：目的研究Per2基因过表达对于U87胶质瘤干细胞放疗敏感性的影响。方法1.应用无血清的培养基(在其中添加生长因子bFGF、生长因子rhEGF、B27试剂和N2添加剂)和悬浮培养法诱导U87胶质瘤干细胞,然后用过表达慢病毒转染胶质瘤干细胞,在荧光显微镜下观察转染效率。2.细胞转染后,利用嘌呤霉素对转染慢病毒的细胞进行筛选,采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印记法检测过表达组、空载体组和正常组U87胶质瘤干细胞内Per2基因表达情况。3.给予8mV 100cGy X线照射三组实验细胞,并分别于24h,48h后,应用蛋白质印记法检测各组细胞γH2AX蛋白表达情况。4.给予8mV 100cGy X线照射三组实验细胞,并分别于24h,48h后,应用Annexin V-PE/PI流式细胞术检测三组实验细胞凋亡情况。结果1.U87胶质瘤干细胞在MOI值为17的条件下,细胞转染效率约为90%,随着MOI值的增加,转染效率没有明显变化。2.用实时荧光定量PCR法和蛋白质印记法检测发现过表达组干细胞内Per2基因表达升高,明显高于其他两组细胞(P0.05),而空载体细胞组和正常细胞组Per2基因的表达情况无明显差异(P0.05)。3.给予三组实验细胞X线照射24h,48h,过表达细胞组干细胞的γH2AX蛋白表达量均高于其他两组细胞(P0.05),而空载体组细胞和空白组细胞γH2AX蛋白表达量无明显差异(P0.05),并且随着时间增加,各组细胞γH2AX蛋白表达量均有所上升4.给予三组实验细胞X线照射24h,48h,过表达组干细胞在24h和48h的细胞凋亡率分别为(45.3±0.75)%和(51±0.82)%,空载体组细胞在24h和48h的细胞凋亡率分别为(25±0.54)%和(29.8±0.49)%,空白组细胞在24h和48h的细胞凋亡率在24h和48h为(22.1±0.48)%和(26.9±0.50)%,过表达组干细胞细胞凋亡率明显高于空载体组和空白组细胞(P0.05),而空载体组细胞和空白组细胞之间细胞凋亡率没有明显差异(P0.05),并且随着放疗后的时间延长,三组细胞的凋亡情况随着时间增加而上升。结论1.使用Per2基因过表达慢病毒转染U87胶质瘤干细胞成功得到Per2基因稳定过表达的U87胶质瘤干细胞株。2.Per2基因过表达时,增加了U87胶质瘤干细胞在接受放疗后DNA损伤标志物γH2AX蛋白的表达量,明显促进细胞DNA的损伤,导致细胞接受放疗后细胞凋亡情况增加,并且随着时间延长,细胞的DNA损伤情况和细胞凋亡情况也随之上升3.Per2基因过表达时,可明显增强U87胶质瘤干细胞对于放疗的敏感性。
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.41
【图文】：

19图 1. 图 A 到图 H 分别为 MOI 值为 1、5、7、10、12、15、17、20 的条件下，慢病毒转染细胞后细胞内荧光表达情况。从图中可以发现随着 MOI 值的不断上升，细胞荧光亮度也在不断增强，在 MOI 值为 17 时，细胞转染效率可达到 90％，继续增大 MOI 值后，细胞转染效率无明显增强。2. 慢病毒转染后 Real-time PCR 检测干细胞内 Per2 基因表达情况

图 4. Wetern  blot 检测三组细胞放疗后γH2AX 蛋白表达图 A：三组细胞放疗后 24hγH2AX 蛋白表达情况，图 B：三组细胞放疗后 48hγH2AX 蛋白表达情况。 细胞分组分别为空载体组干细胞（LV-NC）、过表达组干细胞（LV-OE）和空白组干细胞（Normal）5. 流式细胞术检测干细胞放疗后的凋亡情况使用流式细胞术检测三组细胞凋亡情况后可见（图 4），过表达组干细胞在 24h和 48h 的细胞凋亡率分别为（45.3±0.75）％和（51±0.82）％，空载体组细胞在 24h 和 48h 的细胞凋亡率分别为（25±0.54）％和（29.8±0.49）％，空白组细胞在 24h 和 48h 的细胞凋亡率在 24h 和 48h 为（22.1±0.48）％和（26.9±0.50）％，过表达组干细胞细胞凋亡率明显高于空载体组和空白组细胞（P<0.05），而空载体组细胞和空白组细胞之间细胞凋亡率没有明显差异（P>0.05），并且随

宁夏医科大学 结果24图5. 流式细胞术检测干细胞放疗后的凋亡情况图A：三组细胞的24h细胞凋亡情况的流式图，图B：48h细胞凋亡情况的流式图，图C：24h细胞凋亡率的柱状统计图，图D：48h细胞凋亡率的柱状统计图。24h48hBCD

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本文编号：2761097