锌-α2-糖蛋白在癫痫形成分子机制中作用的研究

发布时间：2020-07-21 07:46

【摘要】：第一部分ZAG在癫痫患者及癫痫动物模型脑组织中的表达目的:探究ZAG在难治性TLE患者皮质及PTZ点燃癫痫大鼠模型海马、皮质组织中的表达及其表达变化。方法:1.收集脑外伤患者手术切除的皮质为对照组(n=20),TLE患者行癫痫灶切除的皮质为癫痫组(n=14)。同时,建立PTZ大鼠癫痫模型(n=20),对照组大鼠腹腔注射生理盐水(n=20);2.运用免疫荧光双标技术研究颞叶癫痫患者和癫痫大鼠脑组织中ZAG的细胞定位。运用RT-q PCR、免疫组织化学及Western blot方法测定癫痫患者和癫痫大鼠脑组织中AZGP1 m RNA和ZAG蛋白表达量的差异;3.运用蛋白免疫印迹方法检测PTZ腹腔注射1天、1周、2周、3周和4周的大鼠脑组织中ZAG的蛋白表达量的变化情况。结果:1.免疫荧光染色结果显示,ZAG主要表达于人脑组织以及大鼠脑组织中的神经元胞质;2.RT-q PCR结果显示癫痫患者及癫痫大鼠脑组织中AZGP1的m RNA水平较对照组明显降低(P0.05);3.免疫组织化学染色和Western blot结果显示ZAG在癫痫患者以及癫痫大鼠模型中水平下降(P0.05);4.在癫痫模型大鼠脑组织中的ZAG表达水平随PTZ注射时间的延长呈进行性加重。结论:ZAG存在于脑组织中,且其可能是由神经元合成,而不是星形胶质细胞。AZGP1 m RNA及ZAG蛋白表达水平在TLE患者与癫痫大鼠模型脑组织中均下降。癫痫大鼠模型脑组织中ZAG蛋白水平与PTZ注射时间呈负相关。ZAG的下降可能在癫痫的发病机制及病理生理中具有重要作用。第二部分ZAG在癫痫发作中的作用机制目的:探索ZAG在癫痫中的可能作用机制。方法:1.验证AAV的转染效果:将成年雄性SD大鼠随机分为四个组(n=20):对照组(Control)、空病毒组(GFP)、AAV注射后3周组(AZGP1-3W)及、AAV注射后9周组(AZGP1-9W)。运用激光共聚焦显微镜观察、RT-q PCR及Western Blot分别检测AAV注射后3周及9周的转染效果;2.探索过表达AZGP1在PTZ大鼠模型中可能的作用机制:另取45只SD大鼠随机分为三个组:对照组(Control)、癫痫组(GFP+PTZ)及过表达病毒组(AZGP1+PTZ)。AZGP1+PTZ与GFP+PTZ组大鼠在AAV注射后3周起,每日接受PTZ腹腔注射共28天,Control组大鼠接受同等剂量的生理盐水腹腔注射。观察各组大鼠的行为学及脑电图(EEG)差异。运用Co-IP检测癫痫组大鼠脑组织中ZAG与p-ERK及ZAG与TGFβ之间是否存在相互结合。运用Western Blot检测各组之间大鼠脑组织中炎症因子TNFα,IL-6,TGFβ,ERK及p-ERK的表达变化情况。结果:1.AAV-AZGP1和AAV-GFP海马立体定位注射后,绿色荧光结果显示海马CA3区有GFP阳性表达。RT-qPCR及免疫印迹及结果显示,与相应时间点对照组相比,AZGP1过表达组AZGP1 m RNA及ZAG蛋白在病毒注射后第3周和第9周显著增加(P0.05);2.Co-IP结果显示ZAG可以与p-ERK及TGFβ结合;3.过表达AZGP1可以降低PTZ诱导的癫痫大鼠模型的癫痫发作评分,延长PTZ点燃的潜伏期,并缓解癫痫样放电的程度;4.过表达AZGP1可以减轻PTZ癫痫模型大鼠的脑组织中TNFα,IL-6,TGFβ水平的升高,并降低ERK的磷酸化水平。结论:ZAG可能通过与TGFβ及p ERK之间的相互作用参与癫痫发生。ZAG可能通过抑制TGFβ介导的ERK磷酸化以及TNFα和IL-6介导的神经炎症从而抑制癫痫发作。ZAG可能是治疗癫痫的潜在新靶点。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R742.1
【图文】：

内参,脑组织,表达水平,患者

差异具有统计学意义(P<0.01)(图1.1)。图 1.1 通过 RT-qPCR 检测 AZGP1 的 mRNA 在 TLE 患者和 PTZ 点燃大鼠的脑组织中的表达水平，GAPDH 作为内参基因。(A）RT-qPCR 结果显示 TLE 患者颞皮质中 AZGP1 mRNA 水平较对照组明显减低

标志物,红色,共表达,星形胶质细胞

28图 1.2 免疫荧光双标检测 ZAG 的细胞表达定位。(A) TLE 患者的颞叶皮质中存在 ZAG 阳性细胞。在颞叶皮质中，ZAG(绿色)与神经元标志物 MAP2(红色）共表达，但未与星形胶质细胞标志物 GFAP（红色）及DAPI 标记的细胞核（蓝色）。(B) PTZ 点燃大鼠海马组织中存在 ZAG 阳性细胞。在海马 CA3 区，ZAG(绿色)与神经元标志物 MAP2(红色）共表达，但未与星形胶质细胞标志物 GFAP（红色）及 DAPI 标记的细胞核（蓝色）。(C) PTZ 点燃大鼠颞皮质中存在 ZAG 阳性细胞。在大鼠颞皮质中，ZAG(绿色)与神经元标志物MAP2(红色）共表达，但未与星形胶质细胞标志物 GFAP（红色）及 DAPI 标记的细胞核（蓝色）。比例尺=

条形图,免疫组织化学染色

图 1.3 免疫组织化学染色测定 ZAG 的表达。(A) ZAG 阳性细胞表达在 TLE 患者和对照组患者的的颞叶皮质中。(B)条形图显示，TLE 患者的 ZAG 阳性细胞的 IOD 值与对照组相比明显减低。(C, E) ZAG 阳性细胞表达在癫痫大鼠和对照组大鼠的海马 CA3 区与相邻皮质。(D,F)条形图显示，癫痫大鼠的海马 CA3 区与相邻皮质的 ZAG 阳性细胞的 IOD 值明显低于对照组。IOD: 积分光密度。*P<0.05，与对照组相比。比例尺= 50μm。Fig 1.3 ZAG expression was measured by immunohistochemistry. (A) ZAG-positive cells in the temporalneocortices of the control and intractable TLE patients. (B) The bar graph shows that the IOD ofZAG-positive cells from the TLE patients was decreased compared with that of the controls . (C, E)ZAG-positive cells in the temporal neocortices and hippocampal CA3 regions of the control and TLE rats.(D,F) The respective bar graph shows that the IOD of ZAG-positive cells was decreased in the temporalneocortices and hippocampal CA3 region of the epileptic rats compared with that of the controls. IOD:Integrated optic density. *P<0.05 versus control. Scale bar = 50 μm.2.5 蛋白印迹检测 ZAG 蛋白在难治性癫痫患者和 PTZ 点燃大鼠脑组织中的表达RT-qPCR 结果显示 AZGP1 mRNA 在 TLE 患者以及癫痫大鼠的脑组织中表达

【相似文献】