MicroRNA-223调控急性缺血性卒中患者氯吡格雷治疗后血小板反应性的机制研究

发布时间：2020-07-21 23:51

【摘要】：背景:氯吡格雷治疗后高血小板反应性系多重因素共同作用的结果,明确氯吡格雷治疗后血小板反应性的调控机制,对于评估药物疗效、做好个体化精准治疗具有十分重要的意义。多项研究均证实miR-223在氯吡格雷治疗后高血小板反应性的发生中可能起到一定的作用,但是其具体的机制尚不清楚,有待更为深入的研究。然而生物信息学分析显示小鼠中miR-223与P2Y12可能并不存在靶向调控关系,这使得动物水平上对于miR-223的研究受到了极大的限制。不仅如此,研究还面临着氯吡格雷作为前体药物需要肝药酶代谢活化才能产生具有药理活性的代谢产物,以及作为药物靶标的血小板为无核终末细胞不能进行长期培养等等技术难题,这些都在某种程度上进一步限制了研究的推进。本研究通过建立氯吡格雷肝微粒体孵育液处理MEG-01细胞的实验模型,使得氯吡格雷可以直接在体外完成代谢活化并进行细胞实验,并利用该细胞模型相关实验与相关临床研究,对氯吡格雷治疗低反应的机制的进行了更深一步的探讨。本研究共分为三个部分。第一部分MicroRNA-223与急性缺血性卒中患者血小板ADP受体P2Y12和氯吡格雷反应性的相关性分析目的:探讨急性缺血性卒中患者氯吡格雷治疗前后血小板膜蛋白P2Y12表达水平与血小板反应性的关系,以及miR-223在其中的调控作用。方法:采用流式细胞术检测急性缺血性卒中患者治疗前后ADP诱导血小板聚集率,通过血小板相对抑制率及八分位数法筛选出低反应组和高反应组,检测极端病例治疗前后血小板中P2Y12蛋白表达水平,并比较分析其在两组极端病例中的差异;构建病毒载体感染人成巨核细胞白血病细胞MEG-01,下调miR-223水平,观察靶基因P2Y12蛋白及mRNA水平表达变化。结果:在急性缺血性卒中患者中,无论在治疗前水平还是治疗后水平,血小板P2Y12的蛋白表达水平与血小板聚集率均呈显著正相关(p0.05)。高反应组治疗后较治疗前P2Y12蛋白表达水平有所降低,但无统计学意义(p=0.073)。低反应组治疗前后血小板P2Y12蛋白表达的改变程度较高反应组显著减低(1.14604 vs 0.77097,p=0.031)。通过构建病毒载体感染下调MEG-01细胞中miR-223水平,可以显著升高P2Y12 mRNA水平和蛋白水平的表达。结论:氯吡格雷低反应组治疗前后血小板P2Y12蛋白表达的相对降低程度较高反应组显著减低;在人血小板前体细胞中,miR-223可以调控ADP受体蛋白P2Y12的表达。第二部分氯吡格雷肝微粒体孵育液处理人成巨核细胞白血病细胞模型的建立及其对miR-223表达的影响目的:建立氯吡格雷肝微粒孵育液处理人成巨核细胞白血病细胞MEG-01的细胞处理模型,并探讨氯吡格雷孵育液处理对miR-223表达所产生的影响,为从细胞水平探索氯吡格雷治疗对人体血小板所产生影响提供新的方法学依据。方法:利用毒理学研究方法,以肝微粒体和氯吡格雷在适宜体系条件下共同孵育,获得含有氯吡格雷活性代谢产物的孵育液。观察不同浓度梯度和不同时间节点氯吡格雷肝微粒体孵育液处理MEG-01细胞后P2Y12蛋白水平的表达变化,确定细胞模型最佳处理浓度和时间,观察细胞中miR-223表达变化。结果:在低(100ul/2ml)、高(200ul/2ml)两种浓度下氯吡格雷孵育液处理MEG-01细胞后,P2Y12蛋白表达均无显著变化(p0.05)。在以200ul/2ml的浓度连续处理5天的条件下,氯吡格雷孵育液组细胞膜P2Y12蛋白表达较对照肝微粒体孵育液组显著降低42.6%(p0.01)。在以200ul/2ml的浓度分别连续处理3天、5天后,氯吡格雷孵育液处理的MEG-01细胞中miR-223表达分别下降了47.3%和32%(p值均0.05)。结论:在以200ul/2ml的浓度连续处理3-5天的条件下,氯吡格雷肝微粒体孵育液处理MEG-01细胞可以简单模拟氯吡格雷活性代谢产物对巨核细胞和血小板产生作用的过程;用氯吡格雷药物治疗3天以上时,miR-223表达水平会显著降低。第三部分氯吡格雷活性代谢产物通过P2Y12-PI3K/Akt-C/EBPα-miR-223通路削弱其本身的P2Y12拮抗剂效应目的:探讨氯吡格雷孵育液处理细胞对C/EBPα表达所产生的影响,以及C/EBPα在氯吡格雷治疗后血小板反应性调控机制中所起的作用。方法:观察氯吡格雷肝微粒体孵育液处理MEG-01细胞后C/EBPα表达的变化;采用LY294002抑制剂处理MEG-01细胞选择性抑制PI3K通路,观察下游C/EBPα、miR-223和P2Y12表达的变化。结果:以200ul/2ml的浓度连续处理5天后,相较于对照肝微粒体孵育液组,氯吡格雷孵育液组细胞膜蛋白P2Y12及转录因子C/EBPα的蛋白表达水平均显著降低(p值均0.01)。连续处理3天或5天后,氯吡格雷孵育液组细胞C/EBPαmRNA表达均显著降低(p值均0.01)。P2Y12 mRNA表达在连续处理3天时升高193.4%(p0.001),在连续处理5天时则显著降低(p0.05,见图)。LY294002处理7天后,MEG-01细胞中PI3K/Akt通路活性被显著抑制,p-Akt蛋白表达水平显著降低,且与抑制剂浓度相关(p值均0.05)。转录因子C/EBPαmRNA及蛋白表达水平均显著降低,但蛋白水平与抑制剂浓度无明显相关。结论:氯吡格雷肝微粒体孵育液处理后,细胞内转录因子C/EBPα的表达会显著降低,并通过P2Y12-PI3K/Akt-C/EBPα-miR-223环路对P2Y12通路的抑制进行负反馈调节。该负反馈调节环路的过度激活,可能与氯吡格雷治疗低反应的发生相关。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R743.3
【图文】：

血小板聚集率,流式,血小板,治疗前后

图 1.1 流式检测 ADP 诱导的血小板聚集率吡格雷治疗前后血小板 P2Y12 蛋白表达的变化筛选出的极端病例治疗前后血样分别进行磁珠分选纯化血小板并白，以 Western blot 检测血小板膜蛋白 P2Y12 相对表达水平。相关不论在治疗前还是治疗后水平，血小板 P2Y12 蛋白表达水平均与呈正相关（治疗前 r=0.814，图 1.2 A；治疗后 r=0.879，图 1.2 B。治疗前后两组极端病例血小板 P2Y12 蛋白相对表达量分布如图。与血小板反应性类似，患者血小板膜蛋白 P2Y12 表达水平在个变异。无论在治疗前水平还是治疗后水平，LR 组与 HR 组相比蛋白表达水平均无显著差异。对每例患者治疗前后的血小板蛋白比较可以发现，LR 组治疗后与治疗前相比无显著变化，而 HR 组前 P2Y12 蛋白表达水平有所降低，但无统计学意义（p=0.073，图据上述结果推测，LR 组与 HR 组在治疗前后血小板 P2Y12 蛋白表上可能存在差异。据此，本研究对每例患者进行了治疗前后蛋白的计算。定义治疗前后血小板 P2Y12 蛋白表达比值 R=治疗后

血小板,氯吡格雷,药物治疗,蛋白表达

p 值均<0.01）。治疗前后两组极端病例血小板 P2Y12 蛋白相对表达量分布如图所示（图1.2 C）。与血小板反应性类似，患者血小板膜蛋白 P2Y12 表达水平在个体间存在较大变异。无论在治疗前水平还是治疗后水平，LR 组与 HR 组相比血小板P2Y12 蛋白表达水平均无显著差异。对每例患者治疗前后的血小板蛋白表达水平进行比较可以发现，LR 组治疗后与治疗前相比无显著变化，而 HR 组治疗后较治疗前 P2Y12 蛋白表达水平有所降低，但无统计学意义（p=0.073，图 1.2 D）。根据上述结果推测，LR 组与 HR 组在治疗前后血小板 P2Y12 蛋白表达的变化程度上可能存在差异。据此

血小板膜蛋白,抗血小板药物

26图 1.3 microRNA-223 对血小板膜蛋白 P2Y12 的调控作用1.3 讨论1.3.1 氯吡格雷治疗后低反应的定义与检测方法抗血小板药物低反应，过去更多被称为抗血小板药物抵抗，可分为临床抵抗和实验室抵抗。前者是指患者服用标准剂量的抗血小板药物却不能有效避免或减少缺血性事件的再发，实验室抵抗是指抗血小板药物不能有效抑制血小板聚集，通过检测发现血小板聚集率等反应血小板功能和活化的指标在治疗后未能产生预期效果。通常研究中噻酚吡啶类药物的实验室抵抗是指阻断 P2Y12 受体信号转导后并未起到抑制二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)介导的血小板聚集效应[23]。

【参考文献】