丙戊酸对面神经切断伤后面运动神经元凋亡的影响及机制研究
发布时间：2020-07-22 01:04
【摘要】：周围性面瘫(peripheral facial paralysis)是临床常见病、多发病,可由病毒感染、创伤、压迫、手术等多种因素引起,其中外伤是导致面神经损伤(facial nerve injury)的重要原因之一。由于面部表情是一种十分重要的非语言交往手段,面瘫的出现对患者的正常交流造成影响,不仅明显降低患者生活质量、影响学习以及工作,严重者甚至损害患者心理健康。关于面神经损伤后病理生理机制尚不明确,近年来越来越多研究已经证实,面神经损伤后不仅面神经纤维本身出现退行性改变,中枢端的神经元胞体也会发生凋亡,这主要是由轴突逆行性变性引发的程序性凋亡反应引起的,进而影响面神经运动功能恢复。尽管相继发现大量信号通路、基因与神经再生、修复相关,但其具体分子机制并不十分清楚。目前临床上多采用神经吻合、神经移植、神经导管等技术恢复神经的完整性,还可局部给予营养神经、促进神经纤维再生及功能恢复的治疗方法,如神经营养因子、神经生长因子、干细胞、电刺激治疗等;虽然这些神经因子与组织工程等治疗性研究被越来越多应用于临床中,但目前并无客观可靠的临床及实验数据支持。因此,阐明面神经损伤后神经再生与修复的病理生理机制,进一步探讨如何促进神经纤维再生及减少神经元胞体死亡成为治疗面神经损伤的重要研究方向。但由于以上这些治疗方法仅仅针对受损神经纤维局部进行修复,并不能直接作用于位于中枢的神经元胞体,而且这些因子多属于大分子多肽类物质,不易通过血脑屏障到达受损神经元,且如果长时间大剂量全身用药,往往可能引起明显的毒副作用。因此,寻找一种能快速穿透血脑屏障、直接保护神经元、促进神经纤维再生的小分子药物已成为近年来众多学者关注的热点之一。丙戊酸(valproic acid,VPA)是临床上常用的一种广谱抗癫痫、抗惊厥药物,属小分子短链脂肪酸,能够迅速透过大脑毛细血管内皮细胞直接作用于中枢神经元,已在临床应用40余年,其安全性、有效性已得到证实。VPA主要通过作用于中枢神经系统来发挥其药理作用,可通过阻断电压敏感性Na+通道和Ca2+通道,进而限制神经元动作电位频率;并能通过抑制γ-氨基丁酸(GABA)代谢酶,增加脑内GABA的合成与释放,降低神经元兴奋性、抑制神经元过度放电以及异常放电的扩散;还可通过激活N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA受体)来降低谷氨酸能神经的兴奋性。基于VPA的这些药理作用,近年来越来越多的学者将其应用于中枢及外周神经系统损伤的修复中来。研究发现,体外细胞培养中,VPA可抑制细胞凋亡,不仅能促进神经干细胞分化为神经元,还可抑制其分化为神经胶质细胞;在体内实验中,中枢及周围神经损伤后VPA具有激活转录、增强基因表达、调控靶蛋白,进而发挥抑制凋亡、保护神经元存活、促进神经轴突再生及神经干细胞迁移及分化、抑制炎症反应、减少胶质细胞增生等作用。但目前尚未有关于VPA对面神经损伤导致的周围性面瘫的是否有保护作用的相关研究。在本实验中,我们通过横断颞骨外段面神经总干建立外伤性周围性面瘫的动物模型,采用Nissl染色、TUNEL染色、免疫荧光及Western blot技术对面神经损伤后面神经功能、面神经元形态、凋亡情况、相关因子表达情况进行观察,探讨这些因子对面神经损伤后神经元存活、面神经功能恢复的影响,并进一步研究损伤后给予VPA治疗对面神经元是否具有神经保护作用,以及可能与此相关的分子机制,为临床上促进面神经再生与修复、功能恢复的治疗方法提供理论依据。目的1.建立颞骨外段面神经干横断伤动物模型,并评估损伤后不同时间点面神经运动功能的恢复情况。2.评估面神经总干损伤后面神经核内神经元的形态及数量变化、凋亡情况及相关因子(Bax、cleaved caspase-3、BDNF、GAP-43)蛋白表达水平的变化。3.探讨VPA对面神经元的保护作用及其可能的分子机制。方法1.150只成年Wistar大鼠随机分为3组,雌雄不分。空白对照组(Sham组)仅解剖暴露颞骨外段面神经总干,不做切断处理。通过切断右侧茎乳孔外0.5cm颞骨外段面神经总干建立大鼠面神经横断伤模型,依据是否使用VPA将剩余两组大鼠分为单纯损伤组(NS组)、丙戊酸组(VPA组)。其中,NS组大鼠每日喂食生理盐水,VPA组大鼠则给予喂食等量的含有VPA(300 mg/kg)的生理盐水。2.术后每天观察大鼠损伤侧的瞬目反射、触须运动及鼻尖位置,并进行评分,依据评分标准来判断面神经功能变化情况。3.三组大鼠分别在术后第1、7、14、21、28天的同一时间内处死,并依据大鼠脑立体定位图谱留取含面神经核的脑干组织制作冰冻切片,留取面神经核组织提取蛋白以进行下一步的免疫荧光及Western blot检测。4.运用Nissl染色法,观察三组面神经核内神经元胞体形态及存活数量情况,TUNEL染色观察发生凋亡的面神经元。5.运用免疫荧光和Western blot检测,从蛋白水平上检测各组大鼠面神经核内Bax、cleaved caspase-3、BDNF、GAP-43 表达含量的变化。结果1.面神经功能评估结果显示,面神经干切断后大鼠出现患侧完全性面瘫,即瞬目反射、触须运动消失,鼻尖偏向健侧;NS组大鼠面神经功能随着观察时间延长逐渐出现面部运动功能恢复,术后第28天可见明显瞬目反射及轻微触须运动,与第7天相比,具有显著差异(p0.05),但仍较健侧面神经功能减低。在各个时间点VPA组大鼠的面神经功能评分均明显高于NS组,差异具有显著性(p0.05)。Sham组大鼠假损伤侧面神经的运动功能与健侧相比并无明显异常。2.Nissl染色结果显示,NS组大鼠面神经损伤后面神经元存活率随着时间逐渐下降,术后 1、7、14、21、28 天分别为 92.95±2.99%、75.21±6.25%、70.30±2.25%、68.30±3.35%、69.38±3.30%,VPA 组面神经元存活率分别为 94.44±5.70%、80.46±3.99%、85.34±0.59%、86.33±1.83%、86.98± 1.76%。由此可见,VPA组大鼠面神经元存活率与NS组比较明显提高,差异具有显著性(p0.05)。NS组中面神经元在神经损伤后第14天形态变化最明显,出现胞体萎缩,尼氏体数量明显减少而且模糊不清,典型者可见到凋亡小体,胞核逐渐固缩并移至靠近细胞膜,严重者胞核完全消失,树突也可见到部分消失;而VPA组大鼠面神经核内异常形态的神经元数量在对应时间点与NS组相比较则明显减少。3.TUNEL染色结果显示,凋亡面神经元胞核标记为红色。术后第1、7、14、21、28天时,Sham组大鼠面神经核内并未见到TUNEL阳性神经元,同样,术后第1天时NS组及VPA组大鼠亦未见到TUNEL阳性细胞;而到了术后第7天时,NS组面神经元开始出现凋亡现象,术后第14天时达到峰值,随后凋亡细胞数逐渐减少,到第28天时仍可见到TUNEL阳性细胞;术后第7、14、21、28 天 NS 组凋亡细胞数分别为 10.7±2.96、15.7±1.45、12.3±1.20、9.0±0.58,而VPA组中第7、14、21、28天凋亡细胞数分别为8.0± 1.53、7.0±0.58、5.3±0.88、5.7±0.79。由上可见,与NS组比较,VPA组在各个时间点其面神经核内凋亡细胞数均有明显下降,差异具有显著性(p0.05)。4.免疫荧光结果显示,Bax、cleaved caspase-3、BDNF、GAP-43均表达于神经元胞质内,而胞核内无明显表达。Sham组中,上述各因子荧光表达均较微弱;而NS组中,Bax蛋白表达在面神经损伤后逐渐增强,到术后第14天达到峰值,随后逐渐减弱,至第28天时荧光表达仍较强;VPA组中,该蛋白在各个时间点的荧光表达均明显弱于NS组,但仍较Sham组增强。NS组中,面神经损伤后cleaved caspase-3蛋白表达逐渐增强,同样在术后第14天达到峰值,随后其表达减弱,至第28天时仍有较强荧光表达;而VPA组中cleaved caspase-3蛋白的荧光表达在各个时间点均较NS组明显减弱,但仍较Sham组增强。NS组中,面神经核内BDNF蛋白表达在面神经损伤后亦逐渐增强,到术后第14天达到峰值,随后逐渐减弱,至第28天时仍有较强表达;而VPA组BDNF蛋白在各个时间点的荧光表达较NS组及Sham组均有所增强。NS组中,面神经损伤后面神经核内GAP-43蛋白表达逐渐增强,到术后第14天达到峰值,后渐减弱,至第28天时仍有较强表达,VPA组GAP-43蛋白荧光表达均明显强于NS组及Sham组。5.Western blot结果显示,面神经损伤后NS组面神经核内Bax、cleaved caspase-3、BDNF、GAP-43蛋白表达具有时间相关性,即损伤后立即出现蛋白含量增高,到损伤后第14天时达高峰,随后各因子蛋白表达均有不同程度下降,至第28天时其含量仍有不同程度增高,这与免疫荧光结果相一致。与NS 组相比,在损伤后第 1、7、14、21、28 天 VPA 组中 Bax、cleaved caspase-3蛋白表达含量均显著降低,而BDNF、GAP-43蛋白表达含量则明显上调,差异具有显著性(p0.05)。结论本课题研究结果表明,面神经损伤后面神经核团神经元不仅胞体发生形态上的改变,还可出现神经元凋亡现象,胞体内蛋白表达亦发生相应变化,这些变化可能与面神经损伤后面部运动功能变化相关。VPA的应用对神经损伤引起的面神经元凋亡现象具有抑制作用,可增加其胞体存活数量,从而促进面神经元细胞功能及面部运动功能恢复。VPA对神经元的这种保护作用可能是通过抑制凋亡相关因子(Bax、cleaved caspase-3)、增加促进神经元存活的因子(BDNF、GAP-43)的表达来实现的。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R745.12
【图文】：
逡逑大鼠行为学观察包括：瞬目反射、触须运动及鼻尖位置（图２）。逡逑ｍｍｍｍｍ逦ｉ逡逑正常大鼠逦面神经损伤后大鼠逡逑图２大鼠面神经损伤前及损伤后面部运动功能逡逑评分标准为：逡逑（１）
１．邋ＶＰＡ可促进面神经损伤后面部运动功能的恢复。逡逑术后每天观察大鼠面神经功能并进行评估直到术后第２８天。功能评分包括：逡逑瞬目反射、触须运动以及鼻尖位置。从图３我们可以看出，面神经损伤后大鼠立逡逑即出现患侧完全性面瘫，评分为０，即患侧眼睑、触须均无动度，鼻尖歪向健侧；逡逑随着观察时间延长，大鼠面神经功能逐渐恢复，ＮＳ组大鼠到第１０天左右出现患逡逑侧眼睑轻微眨眼活动，但不能完全闭合，患侧触须无明显抖动，鼻尖仍偏斜向健逡逑侧，直到第１６天患侧眼睑动度明显增加，可不完全闭合，功能评分为１分；而第逡逑２２天后右侧眼睑几乎可完全闭合，患侧触须轻微抖动，鼻尖仍歪向健侧，评分维逡逑持在２分左右。而ＶＰＡ组大鼠面神经功能恢复地更快、更好，术后第７天即出现患逡逑侧眼睑活动，术后第１６天患侧眼睑可完全闭合，触须出现抖动，评分达到２分左逡逑右
散在均匀分布，并可延续到树突中，可见树突呈放射状，形如树枝，神逡逑经元胞膜连续完整，胞核位于神经元胞体中央，大而圆，边界清楚，核仁明显可逡逑见（图４Ａ＆Ｄ）；面神经损伤可引起一系列面神经元结构的改变，如ＮＳ组中神逡逑经元在神经损伤后第１４天出现胞体萎缩，尼氏体数目减少，模糊不清，甚至可见逡逑到凋亡小体，胞核固缩并移位至细胞边缘，严重者胞核消失，神经元树突不明显逡逑但胞膜完整（图４Ｂ＆Ｅ）；而ＶＰＡ组与ＮＳ组相比较，在相同时间点则可见到更逡逑多正常形态面神经元（图４Ｃ＆Ｆ）。逡逑Ｓｈａｍ逦ＮＳ逦ＶＰＡ逡逑Ａ逦，邋Ｂ邋＇逦、勺？邋ｗ邋＊邋Ｃ邋－逦４０逦．邋＾逡逑广ｆ逦＾邋ｒ邋■久１ｆｕｗ逡逑声邋５邋＾邋分人邋４逦。ｔ邋ｕ邋ｉ逡逑旮邋ｆ逦Ｔ．ｖp海垮义贤迹村澹危椋螅螅烊旧允久嫔窬鹕撕蟮冢保刺烀嫔窬翁峁贡浠义险Ｃ嫔窬玻痢ⅲ煤谏罚皇芩鹈嫔窬ǎ掳咨罚＃摹ⅲ拧ⅲ棋义戏直鹞髯槊嫔窬糯笸枷瘛＃ū壤撸剑保埃郏保保保保╁义仙窬剖峁缤迹邓荆嫔窬鹕丝梢鹈嫔窬劳觯⒃谒鹕撕箦义系冢保刺熳钛现兀笠恢背中了鹕撕蟮冢玻柑欤挥耄樱瑁幔碜橄啾龋危幼樗鹕撕蟮冢卞义咸焐窬壤⑽疵飨韵陆担梗玻梗低粒玻梗梗ィ鹕撕蟮冢贰ⅲ保础ⅲ玻薄ⅲ玻柑旆直疱义衔罚担玻
本文编号：2765088
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R745.12
【图文】：
逡逑大鼠行为学观察包括：瞬目反射、触须运动及鼻尖位置（图２）。逡逑ｍｍｍｍｍ逦ｉ逡逑正常大鼠逦面神经损伤后大鼠逡逑图２大鼠面神经损伤前及损伤后面部运动功能逡逑评分标准为：逡逑（１）
１．邋ＶＰＡ可促进面神经损伤后面部运动功能的恢复。逡逑术后每天观察大鼠面神经功能并进行评估直到术后第２８天。功能评分包括：逡逑瞬目反射、触须运动以及鼻尖位置。从图３我们可以看出，面神经损伤后大鼠立逡逑即出现患侧完全性面瘫，评分为０，即患侧眼睑、触须均无动度，鼻尖歪向健侧；逡逑随着观察时间延长，大鼠面神经功能逐渐恢复，ＮＳ组大鼠到第１０天左右出现患逡逑侧眼睑轻微眨眼活动，但不能完全闭合，患侧触须无明显抖动，鼻尖仍偏斜向健逡逑侧，直到第１６天患侧眼睑动度明显增加，可不完全闭合，功能评分为１分；而第逡逑２２天后右侧眼睑几乎可完全闭合，患侧触须轻微抖动，鼻尖仍歪向健侧，评分维逡逑持在２分左右。而ＶＰＡ组大鼠面神经功能恢复地更快、更好，术后第７天即出现患逡逑侧眼睑活动，术后第１６天患侧眼睑可完全闭合，触须出现抖动，评分达到２分左逡逑右
散在均匀分布，并可延续到树突中，可见树突呈放射状，形如树枝，神逡逑经元胞膜连续完整，胞核位于神经元胞体中央，大而圆，边界清楚，核仁明显可逡逑见（图４Ａ＆Ｄ）；面神经损伤可引起一系列面神经元结构的改变，如ＮＳ组中神逡逑经元在神经损伤后第１４天出现胞体萎缩，尼氏体数目减少，模糊不清，甚至可见逡逑到凋亡小体，胞核固缩并移位至细胞边缘，严重者胞核消失，神经元树突不明显逡逑但胞膜完整（图４Ｂ＆Ｅ）；而ＶＰＡ组与ＮＳ组相比较，在相同时间点则可见到更逡逑多正常形态面神经元（图４Ｃ＆Ｆ）。逡逑Ｓｈａｍ逦ＮＳ逦ＶＰＡ逡逑Ａ逦，邋Ｂ邋＇逦、勺？邋ｗ邋＊邋Ｃ邋－逦４０逦．邋＾逡逑广ｆ逦＾邋ｒ邋■久１ｆｕｗ逡逑声邋５邋＾邋分人邋４逦。ｔ邋ｕ邋ｉ逡逑旮邋ｆ逦Ｔ．ｖp海垮义贤迹村澹危椋螅螅烊旧允久嫔窬鹕撕蟮冢保刺烀嫔窬翁峁贡浠义险Ｃ嫔窬玻痢ⅲ煤谏罚皇芩鹈嫔窬ǎ掳咨罚＃摹ⅲ拧ⅲ棋义戏直鹞髯槊嫔窬糯笸枷瘛＃ū壤撸剑保埃郏保保保保╁义仙窬剖峁缤迹邓荆嫔窬鹕丝梢鹈嫔窬劳觯⒃谒鹕撕箦义系冢保刺熳钛现兀笠恢背中了鹕撕蟮冢玻柑欤挥耄樱瑁幔碜橄啾龋危幼樗鹕撕蟮冢卞义咸焐窬壤⑽疵飨韵陆担梗玻梗低粒玻梗梗ィ鹕撕蟮冢贰ⅲ保础ⅲ玻薄ⅲ玻柑旆直疱义衔罚担玻
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