MicroRNA-148a通过靶向调控GADD45促进神经胶质瘤的迁移和侵袭

发布时间：2020-07-22 15:29

【摘要】：目的:本课题拟通过寻找mir-148a的靶基因,验证mir-148a与靶基因之间的相互作用并研究其对神经胶质瘤细胞迁移和侵袭能力的影响。方法:1、运用生物信息学预测软件TargetScan、miRanda、PicTar、PITA筛选和预测mir-148a的靶基因;2、运用生物素标记的RNApull down筛选mir-148a的靶基因;3、运用荧光素酶报告基因验证mir-148a的靶基因;4、运用荧光定量PCR和Western Blot的方法检测GADD45在mir-148a过表达和抑制表达稳定细胞系中的基因和蛋白表达水平;5运用transwell迁移和侵袭实验、划痕实验来验证mir-148a通过靶向调控GADD45促进神经胶质瘤的迁移和侵袭作用。结果:1、生物信息学预测软件TargetScan、miRanda、PicTar、PITA分别预测mir-148a的靶基因434个、7402个、434个、1847个,根据预测网站的评分及同源序列对比和互补,初步预测MEOX2-1、MEOX2-2、GADD45A-1、GADD45A-2、AG04、DLGAP1 为 mir-148a 的潜在靶基因。2、生物素标记的RNApull down结果表明,以DNMT1为阳性对照,初步筛选只有GADD45A-2是mir-148a的靶基因。3、荧光素报告基因活性检测的结果证实,mir-148a能与GADD45 3'UTR区结合,抑制其报告基因的荧光强度,这些结果确证,miR-148a通过GADD45A基因3'UTR上的该位点来调控基因的表达,GADD45是mir-148a的靶基因。此外,qRT-PCR和Western Blot实验的结果表明,与正常神经胶质细胞相比,GADD45在神经胶质瘤细胞系的表达明显下调,且差异具有统计学意义(P0.05)。4、通过构建GADD45过表达慢病毒载体(pLent-GADD45),感染神经胶质瘤U251、U87细胞系,建立了 GADD45过表达稳定细胞系。5、利用荧光定量PCR和Western Blot分析,验证了 mir-148a过表达下调GADD45基因和蛋白表达,mir-148a抑制表达时结果相反。这些结果证明mir-148a对GADD45存在调控作用。6、构建过表达GADD45慢病毒载体(pLent-GADD45),感染神经胶质瘤U87、U251细胞系后进行transwell迁移和侵袭实验、划痕实验,发现过表达GADD45减弱U87、U251的迁移和侵袭能力。结论:1、GADD45 是 mir-148a 的靶基因;2、mir-148a通过靶向调控GADD45促进神经胶质瘤细胞的迁移和侵袭。
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.4
【图文】：

逦：邋ＬｏｇＳｃａｉｅ逦Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，邋Ｃｅｌｓｉｕｓ逡逑图１－２：逦ＲＴ－ＰＣＲ的扩增曲线和融解峰。逡逑６０－１邋＊逡逑ｃ逦Ｊ，逡逑0邋＊逡逑＇ｌ逡逑？４0＿逦＿ｒ．逡逑Ｓ－逡逑①邋＊逡逑ＴＯ逡逑芽邋２０－逦［３１，逦＊逡逑＾逦姦ｌ逡逑0N0——Ｍ——Ｍ——Ｍ——Ｍ—逡逑ＨＡ邋１８００逦ＢＴ３２５逦Ｕ２５１逦Ｕ８７逦ＳＷ０３８逡逑图１－３：逦ｍｉｒ－１４８ａ在神经肢质瘤细胞系中的表达与神经胶质细胞ＨＡ１８００比较．？邋＞＜０．０５。逡逑９逡逑

逦硕士学位论文逦逡逑ＤＬＧＡＰ１为ｍｉｒ－１４８ａ的潜在耙基因（见图２－１）。其中在ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ中我们查询逡逑了邋ＧＡＤＤ４５邋（ＮＭ００１９２４．３）邋３’ＵＴＲ邋处有邋８ｍｅｒ邋大小片段和邋ｍｉｒ－１４８ａ邋结合（见图逡逑２－２）。逡逑己验证个数逡逑＊

从而与其他成分分离。复合物洗脱后，检测特定的ＲＮＡ结合蛋白是否与ＲＮＡ逡逑相互作用。逡逑图２－３、图２－４数据所示为存在有统计学意义的Ｉｎｐｕｔ值的靶基因，即总ＲＮＡ逡逑中检测到的ＲＮＡ。ＤＮＭＴ１作为阳性对照，结果表明了图示基因中只有逡逑ＧＡＤＤ４５Ａ－２邋是邋ｍｉｒ－１４８ａ邋的靶基因。逡逑ＤＮＭＴ１邋ＭＥＯＸ２－１邋ＭＥＯＸ２－２逦ＡＧ０４邋ＧＡＤＤ４５Ａ－１邋ＧＡＤＤ４５Ａ－２逡逑ｂｐ邋Ｍ／，癌／／＂／＂／＂／＂逡逑＆邋三ｉ逡逑２００—逡逑１Ｃ．：—ｉ逦。逦…、…厂逡逑ＤＬＧＡＰｔ逡逑ｂＰ邋／，／逡逑５００＿ｒ：逡逑４０３邋一ｋ逦：邋？逡逑１００逡逑图２－３：待测靶基因ＲＮＡ邋ＰＵＬＬ邋ＤＯＷＮ产物的凝胶电泳图。逡逑ｓ邋－｜逡逑■邋ｃｏｎｌｒｄ逡逑＾逦＊邋ｍｉＦ－ｌ４Ｓａ－３ｐ逡逑ｔ邋６－逡逑％逡逑＾逦４－逦？逡逑ｓ邋Ｓ逡逑量ｄ邋ｉ‘＇气逦，逡逑□逡逑ｓｅ逡逑ｓ，逡逑０．０－１一＂逦Ｔ逦Ｔ－＊邋邋，邋逡逑图２－４：以ＤＮＭＴ１为对照，ＧＡＤＤ４５Ａ－２的ｉｎｐｕｔ值有阳性反应：＞＜０．０５。逡逑２１逡逑

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本文编号：2766009