硫辛酸抑制AIF介导的非Caspase凋亡对6-OHDA诱导的帕金森病模型神经元的保护作用研究

发布时间：2020-07-23 13:07

【摘要】：目的:探讨硫辛酸(Lipoic Acid,LA)能否通过抑制凋亡诱导因子(Apoptosis-inducing factor,AIF)介导的非Caspase依赖性凋亡通路对多巴胺能神经元起保护作用,为临床上治疗帕金森病(Parkinson's disease,PD)提供相关实验依据。方法:(1).通过6-羟多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)诱导PC12细胞损伤建立PD细胞模型,给予LA(75μmol/L)干预;通过CCK-8法检测细胞活力、荧光探针DCFH-DA检测活性氧水平、荧光探针JC-1检测线粒体膜电位、流式检测凋亡;通过Western blot检测酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)表达。(2).健康雄性SD大鼠,随机分为6-OHDA组(n=40)和假手术组(n=15),向6-OHDA组SD大鼠右侧纹状体注射6-OHDA,假手术组注射等体积的生理盐水做为对照。术后第四周通过阿扑吗啡(Apomorphine,APO)旋转实验筛选出成功的PD大鼠模型大鼠(向健侧旋转圈速2 r/min);随机将成功的PD大鼠模型分为PD模型组和LA干预组;术后第五周起,LA干预组给予硫辛酸(50 mg/kg/d)干预14 d。采用旋转实验和圆筒实验,检测PD模型大鼠行为学变化;采用免疫组化检测大鼠损毁侧神经元特异性标志物神经核抗原(Neuron-specific nuclear antigen,NeuN)的和多巴胺能神经元特异性标志物TH的表达,检测LA对6-OHDA损毁的大鼠黑质区域神经元和DA能神经元的影响。(3).在PD细胞模型和大鼠模型中,通过Western blot检测LA对6-OHDA诱导的PD模型线粒体和细胞核中AIF表达量的影响;通过激光共聚焦显微镜观察LA对6-OHDA诱导PD模型中AIF定位的影响。结果:(1).体外实验结果显示:75μmol/L的6-OHDA处理PC12细胞18 h后细胞活力下降至65.28±4.13%;而经10μmol/L LA预处理后加入75μmol/L的6-OHDA共培养18h,PC12细胞的细胞活力升至80.00±5.41%。与正常对照组相比;PC12细胞在6-OHDA的诱导下细胞内活性氧含量显著升高(P0.05),细胞线粒体膜电位显著降低(P0.05),细胞凋亡率显著升高(P0.05),TH表达量显著降低(P0.05)。与6-OHDA组相比,LA的预处理后再加入6-OHDA共培养;PC12细胞活性氧含量显著降低(P0.05),线粒体膜电位显著升高(P0.05),细胞凋亡率显著降低(P0.05),TH表达量显著升高(P0.05)。(2).体内实验结果显示:与假手术组相比;PD模型组和LA干预组在APO的诱导的旋转实验中向健侧旋转圈显著升高(P0.05),筒实验中左前肢使用频率显著下降(P0.05);损毁侧黑质区NueN和TH阳性细胞数显著降低(P0.05)。与PD模型组相比;LA干预组在旋转实验中向健侧旋转圈数显著下降(P0.05),在圆筒实验中左前肢使用频率显著升高(P0.05);损毁侧黑质区NueN和TH阳性细胞数显著升高(P0.05)。(3)体/内外实验结果均显示:与对照组相比;PC12细胞或大鼠黑质神经元,在6-OHDA的诱导下,线粒体中AIF表达量显著降低(P0.05),而核内AIF表达量显著升高(P0.05),且AIF与细胞核出现共定位现象。与PD模型组相比;经LA干预后,线粒体中AIF表达量显著升高(P0.05),而核内AIF表达量显著降低(P0.05)。结论:(1).LA通过抑制活性氧(Reactive oxygensPecies,ROS)的产生、线粒体功能障碍和凋亡对6-OHDA诱导损伤的PC12细胞起保护作用。(2).LA缓解PD模型大鼠行为学改变。(3).LA减缓6-OHDA诱导下PD模型大鼠中脑黑质神经元和多巴胺能神经元的丢失。(4).AIF介导的非Caspase依赖性凋亡通路参与了6-OHDA诱的多巴胺能神经元的丢失过程。(5).LA可以通过抑制黑质区AIF介导的非Caspase依赖性凋亡通路而保护多巴胺能神经元。
【学位授予单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R742.5
【图文】：

结果以 ±s 表示，n = 3，与正常对照组（Ctrl 组）相比，#P< 0.05；与 PD 模型组（6-OHD组）相比，*P< 0.05。图 2-13 注射侧黑质区域线粒体与细胞核中 AIF 表达量Fig. 2-13Western blot analyses of AIF Protein from SNPc of lesioned hemisphere

：图中箭头所指表示 AIF 核转移的神经元；标尺：20μm。图 2-14 注射侧黑质区域 Confocal 结果图Fig 2-14Confocal microscoPe images showing the AIF translocation into the nucleus

【参考文献】

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本文编号：2767360