消退素D1对小胶质细胞自噬的影响及机制研究

发布时间：2020-07-23 20:36

【摘要】：第一部分消退素D1对小胶质细胞自噬的影响目的:研究消退素D1(Resolvin D1,RvD1)能否促进小胶质细胞自噬发生,以及对自噬流的影响。方法:以小鼠小胶质细胞系BV-2为研究对象,实验共分为A、B和C三部分。A部分研究RvD1促进小胶质细胞自噬的最佳浓度,实验分为四组:(1)对照组;(2)RvD1(10 nM)组;(3)RvD1(50 nM)组;(4)RvD1(100 nM)组。2h后提取总蛋白,使用western blotting技术检测自噬的标记物LC3的表达水平。B部分研究RvD1促进小胶质细胞自噬的最佳时间,实验共分为两批。第一批为早期阶段:(1)对照组;(2)15min组:RvD1(50 nM)刺激细胞15min;(3)30min组:RvD1(50 nM)刺激细胞30min。使用western blotting技术检测影响自噬启动的上游指标ULK1、BECN1和P62的表达。第二批为晚期阶段:(1)对照组;(2)1h组:RvD1(50 nM)刺激细胞1h;(3)2h组:RvD1(50 nM)刺激细胞2h。使用western blotting技术检测自噬标记物P62和LC3的蛋白水平。C部分研究RvD1对小胶质细胞自噬流的影响,因而本实验中使用PI3K抑制剂LY294002(LY)抑制自噬早期阶段,使用氯喹(CQ)抑制自噬小体与溶酶体融合来抑制自噬晚期阶段,实验共分为四组:(1)对照组;(2)RvD1(50 nM)组;(3)CQ(20μM)+RvD1组;(4)LY(10μM)+RvD1组。其中CQ于RvD1前22h给药,LY于RvD1前2h给药,在RvD1刺激细胞2h后提取总蛋白,使用western blotting技术检测P62和LC3的蛋白水平,并使用透射电镜和荧光共聚焦显微镜观察小胶质细胞胞内自噬体的形成。结果:A部分结果显示,和对照组比较,10 nM、50 nM和100nM的RvD1可不同程度地促进小胶质细胞LC3-II/LC-I的比值增加,而50 nM浓度时该作用更为显著。B部分结果显示,和对照组比较,RvD1刺激早期(15min和30min),影响自噬启动的上游指标ULK1、BECN1和P62的表达均无显著变化,而在刺激晚期(1h和2h),LC3-II/LC-I比值显著升高,P62的降解显著增加,其中2h时该作用更为显著。C部分结果显示,和对照组相比,RvD1组的LC3-II/LC-I比值显著增加,P62蛋白水平显著下降;和RvD1组相比,LY+RvD1组的LC3-II/LC-I比值和P62的表达水平均无显著变化,但CQ+RvD1组的LC3-II/LC-I比值进一步升高。通过透射电镜可观察到小胶质细胞胞内自噬小体和自噬溶酶体的生成,荧光共聚焦显微镜也观察到自噬的激活。结论:RvD1可促进小胶质细胞自噬的发生,其促进自噬的最佳浓度为50 nM,最佳时间为刺激后2h;RvD1可促进小胶质细胞自噬小体的生成及自噬小体与溶酶体的融合。第二部分消退素D1激活小胶质细胞自噬与mTOR通路的关系目的:研究RvD1激活小胶质细胞自噬是否通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路。方法:以小鼠小胶质细胞系BV-2为研究对象,实验共分为A、B和C三部分。A部分研究RvD1对mTOR通路的影响,实验共分为两批。第一批为早期阶段:(1)对照组;(2)15min组:RvD1(50 n M)刺激细胞15min;(3)30min组:RvD1(50 n M)刺激细胞30min。第二批为晚期阶段:(1)对照组;(2)2h组:RvD1(50 n M)刺激细胞2h;(3)4h组:RvD1(50 n M)刺激细胞4h;(4)6h组:RvD1(50 n M)刺激细胞6h。使用western blotting技术检测mTOR、P-mTOR及其底物ULK1、P-ULK1、4E-BP1、P-4E-BP1、S6K和P-S6K的表达水平。B部分研究RvD1激活小胶质细胞自噬是否依赖mTOR通路,本实验中使用了mTOR的抑制剂雷帕霉素(Rapa)和激动剂3BDO作为对照,实验共分为四组:(1)对照组;(2)RvD1(50 n M)组;(3)Rapa(50n M)组;(4)3BDO(50μM)组。在刺激细胞6h后提取总蛋白,使用western blotting技术检测P62、LC3及mTOR的底物P-ULK1、ULK1、P-4E-BP1、4E-BP1、P-S6K、S6K的表达。C部分研究RvD1激活小胶质细胞自噬是否通过调控胞内Ca~(2+)水平,本实验中使用花生四烯酸(AA)诱导细胞胞内Ca~(2+)水平升高和CAMK2磷酸化,实验共分为四组:(1)对照组;(2)AA(50μM)组;(3)RvD1(50n M)组;(4)AA+RvD1组。预先用AA或等体积溶剂刺激细胞2h,再给予RvD1或等体积溶剂继续培养2h,使用流式细胞术检测细胞内Ca~(2+)的水平,并使用western blotting检测P-CAMK2和CAMK2的表达。结果:A部分结果显示,和对照组相比,RvD1在刺激细胞早期(15min和30min)对mTOR及其底物ULK1、4E-BP1、S6K的表达均无显著影响,而在刺激细胞晚期(2h、4h和6h),RvD1可增强mTOR及其底物ULK1、4E-BP1、S6K的磷酸化水平,其中6h时该作用更为显著。B部分结果显示,和对照组相比,RvD1组LC3-II/LC-I比值显著升高,ULK1、4E-BP1和S6K的磷酸化水平也显著升高,Rapa组LC3-II/LC-I比值显著升高,P62表达显著降低,ULK1、4E-BP1、S6K的磷酸化水平显著降低,而3BDO组与Rapa组的作用相反。C部分结果显示,和对照组相比,单独给予RvD1不影响细胞胞内Ca~(2+)水平和P-CAMK2、CAMK2的表达,AA刺激细胞后胞内Ca~(2+)水平和CAMK2的磷酸化均显著增加。和AA组比较,AA+RvD1组的胞内Ca~(2+)水平和P-CAMK2水平均显著下降。结论:RvD1在刺激小胶质细胞晚期可激活mTOR通路;RvD1激活小胶质细胞自噬不依赖mTOR通路。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R741
【图文】：

小胶质细胞,自噬

科技大学博士学位结果D1 对小胶质细胞自噬的影响前期实验，RvD1 能够在 10nM 和 100nM 的浓度，因此，为了研究 RvD1 能否促进小胶质细胞自00nM 三种浓度的 RvD1 来进行研究。将含等体的培养基培养细胞 2h，然后收集总蛋白，使用 LC3-II/LC3-I 比值的变化。

小胶质细胞,自噬

华中科技大学博士学位论文D1 刺激早期对小胶质细胞自噬上游指标的影响了进一步研究 RvD1 激活小胶质细胞自噬的最佳处理时间，我们使用 5 培养小胶质细胞 15min 和 30min，然后收集总蛋白，使用 western blotti响自噬启动的上游指标 ULK1、BECN1 和 P62 的变化。

小胶质细胞,自噬

图 1-3 RvD1（50nM）刺激晚期对小胶质细胞 LC3 和 P62 的影响。** P＜0.01，与 Veh 组比较果显示（见图 1-3），和对照组相比，RvD1 刺激小胶质细胞 1h 和 2h 时-II/LC3-I 比值并促进 P62 降解（P＜0.01），而刺激 2h 时该作用更为显vD1 刺激小胶质细胞晚期（1h、2h）能明显激发自噬，因此，后续实验间点进行研究。1 对小胶质细胞自噬流的影响D1 能够明显激活小胶质细胞自噬，但是其对小胶质细胞自噬流的影响此，我们使用氯喹（CQ）抑制自噬小体和溶酶体的融合来抑制自噬的及 PI3K 抑制剂 LY294002（LY）来抑制自噬的早期阶段，进一步研质细胞 LC3-II/LC3-I 比值和 P62 表达的影响。

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