Snhg12在脑缺氧缺糖损伤中的作用及机制研究

发布时间：2020-07-28 09:26

【摘要】：目的缺血性脑卒中是人类主要死亡原因之一,同时它也是致使成年人肢体残障的重要因素。在此,我们以氧糖剥夺/复氧复糖(Oxygenglucose deprivation/Reoxygen,OGD/R)为模型探讨长链非编码RNA(LncRNA)Snhg12在脑缺氧缺糖损伤中的作用以及信号传导机制。方法以原代神经元细胞为实验对象。使用PCR检测Snhg12在各不同处理的原代神经元中的表达。应用原位杂交实验检测Snhg12在原代神经元内的定位。神经元细胞毒性损伤程度以及存活率使用MTT比色分析实验、乳酸脱氢酶(LDH)活力测定实验、Western blot检测Bcl-2/Bax来分析。Western blot检测下游靶基因Akt的表达改变。结果OGD/R处理对原代神经元造成细胞毒性作用:LDH释放增加死亡率上升、存活率下降,且损伤随着缺氧缺糖和复氧复糖时间的增加而加重。其中以缺氧缺糖12h和复氧复糖24h对原代神经元细胞产生的细胞毒性损伤最为显著。Snhg12在OGD12h/R24h处理后表达水平达到最高。Snhg12在原代神经元的细胞核与细胞质中均大量广泛表达。Snhg12敲减后的原代神经元在OGD/R处理后,细胞毒性损伤增加:LDH释放增加死亡率上升、存活率下降、Bcl-2水平下降、Bax水平升高、Bcl-2/Bax比值下降。Snhg12敲减组原代神经元细胞在OGD/R处理后,Akt总水平不变、p-Akt减少、p-Akt/Akt比值下降。结论OGD/R处理导致原代神经元细胞毒性损伤,Snhg12在细胞遭受OGD/R损伤后显著升高产生保护作用,且Snhg12通过调节Akt磷酸化从而介导OGD/R诱导的原代神经元毒性损伤的保护。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R743
【图文】：

13图 1. 原代神经元细胞接种后不同时间光镜下的形态改变Figure 1. Changes of primary neuron under optical microscope-OGD 组接种后 2h。b.Non-OGD 组接种后 4h。c.Non-OGD 组接种后 1 天。d.No后 3 天。e. Non-OGD 组接种后 7 天。f. OGD12h/R24h 组接种后 7 天。 不同缺氧缺糖和复氧复糖时间诱导原代神经元产生细胞毒性损伤了验证 OGD/R 处理对原代神经元产生细胞毒性损伤的影响。我们控与缺氧缺糖时间中的一项不变，改变另一项，运用 MTT 比色分析实验和测定实验检测 OGD/R 对原代神经元产生的细胞毒性损伤。BLANK 组性对照组，Non-OGD 组为未经 OGD/R 处理的对照组。氧缺糖时间分别为 2h、4h、8h、12h，复氧复糖时间为 24h。LDH 活显示各组死亡率为 0.85 0.16%（Non-OGD）、35.97 3.11%（OGD2h/R

15图 2. 不同缺氧缺糖和复氧复糖时间诱导原代神经元产生细胞毒性损伤Figure 2. Different time of OGD/R induces neuronal damagea. 控制缺氧缺糖时间分别为 2h、4h、8h、12h，复氧复糖时间为 24h，检测各组 LDH 释放程度，即细胞死亡率（**p<0.01）。b. 控制缺氧缺糖时间分别为 2h、4h、8h、12h，复氧复糖时间为 24h，MTT 比色分析实验检测各组神经元存活率（**p<0.01）c. 控制复氧复糖时间分别为 6h、12h、24h，缺氧缺糖时间为 12h，检测各组 LDH 释放程度，即细胞死亡率（**p<0.01）d. 控制复氧复糖时间分别为 6h、12h、24h，缺氧缺糖时间为 12h，MTT 比色分析实验检测各组神经元存活率（**p < 0.01）。1.4 讨论在临床上，脑卒中是围术期非常严重的并发症，发病率在0.05%-7%，也是患者在围术期死亡的重要原因之一。在心脏以及脑部手术中，脑卒中的发生的主要机制是灌注不足、栓塞和血液稀释[11-13]。在非心脏及脑部手术中，机制主要有：

图 3. pGMLV-SC5 RNAi 慢病毒载体Figure 3. Lentiviral vector针对本课题需要的目标基因靶基因序列，设计 3 个 shRNA 靶点（表 8）表 8. 针对目标基因靶基因序列设计 3 个 shRNA 靶点Table 8. Target sequencesNO. TargetSeq1 GCCTTGTACTTCTACCCAACG2 GGACAACGATACAGCAGAAGG3 GCCTGGCCTACATTGAGAAAC设计合成 shRNA 寡聚单链 DNA，Oligo 序列见表 9。

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本文编号：2772688