内质网应激与蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的相关性研究

发布时间：2020-07-28 10:01

【摘要】：目的本课题拟通过建立蛛网膜下腔出血(SAH)大鼠模型,检测建模后1h、6h、12h、24h、48h、72h神经功能损害评分、脑水肿程度、海马神经元凋亡水平以及脑组织内与内质网应激(ER stress)相关的表达因子CAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、海马葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和Caspase-12的表达,并与空白对照组和假手术组对照比较,来探讨ER stress与SAH后早期脑损伤(EBI)的相关性及作用机制。材料和方法1.选取成年雄性SD大鼠78只,体质量(300±50)g,采用随机数字表法将大鼠分为空白对照组6只、假手术组36只与SAH组36只。2.采用视交叉前池注血法建立SAH模型。大鼠穿刺点在冠状缝前5mm、中线旁开3 mm处。假手术组注入生理盐水0.3ml,SAH组注入自体动脉血0.3 ml。3.参照Kaoutzanis等的行为学评分进行神经功能缺陷评分:观察进食、运动反应、睁眼反应。总分11分,最低3分。对各组大鼠各时间点进行神经行为学评分。4.组织固定及处理:断头法取脑,取下两侧海马及额叶底部脑组织,用于检测Caspase-12、CHOP、GRP78蛋白的表达、神经元凋亡细胞水平,剩余脑组织用于干湿重测定评估脑水肿情况。5.TUNEL法检测大鼠海马神经元凋亡细胞。6.Western blot法检测CHOP、GRP78、Caspase-12蛋白的定量表达。7.干湿称重法计算脑组织标本水含量来反映脑水肿程度:计算公式为:脑组织含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。8.电镜观察细胞形态,了解神经元凋亡情况。9.统计学处理:实验所得数据全部采用二因素方差分析,并利用LSD法进行多重比较。对于各个指标两两之间计算Pearson相关系数,并进行显著性测验。P0.05为差异有统计学意义。结果1.建立SAH模型结果:SAH组建模中有1只大鼠因麻醉死亡,3只大鼠因注血后72h内死亡,病死率11.11%;假手术组建模中有2只大鼠因麻醉死亡,1只大鼠注生理盐水后72h内死亡,病死率8.33%;空白对照组无死亡,病死率0;三组实验死亡率比较差异无统计学意义(P0.05),及时补充7只大鼠继续实验。解剖取脑标本后空白对照组、假手术组无蛛网膜下腔出血或仅有少许蛛网膜下腔出血;SAH组大鼠取脑后在Willis环周围可见明显蛛网膜下腔积血,部分标本在视交叉池、环池、脚间池等脑池处可见较多血凝块。2.神经功能缺陷评分结果:(1)大鼠经水合氯醛溶液腹腔麻醉后1h未完全清醒,无法进行神经功能缺陷评分。一般3h后大鼠逐渐恢复清醒,故从6 h开始评分。(2)空白对照组、假手术组各时间点评分无明显变化,接近满分,两组比较组内、组间无显著统计学差异(P0.05)。(3)SAH组评分6h开始下降,24h达到谷值,然后逐渐上升,第6h、12h、24h、48h、72hSAH组与空白对照组、假手术组比较明显降低,组间比较有显著统计学差异(P0.05)。(4)SAH组在24h时间点下降最为明显,组内与其他时间点比较有显著统计学差异(P0.05)。3.脑水肿检测:(1)空白对照组及假手术组脑水肿程度轻微,组间、组内各时间点比较无显著统计学差异(P0.05)。(2)SAH组6h脑水肿开始加重,24h达到峰值,48、72h脑水肿仍较重。第12、24、48、72h SAH组与空白对照组、假手术组比较脑水肿明显,有显著统计学差异(P0.05)。(3)SAH组在24h时间点水肿最严重,与1h、6h、12h、72h比较组内有显著统计学差异(P0.05),但与48h时间点比较无统计学意义(P0.05)。4.TUNEL法检测神经元凋亡结果:(1)空白对照组、假手术组海马神经元凋亡不明显,组间、组内比较差异无显著统计学差异(P0.05)。(2)SAH组神经元凋亡较明显,12h凋亡细胞明显增多,24h凋亡细胞达到峰值,48 h凋亡细胞数目开始逐渐下降,72h凋亡细胞数目明显减少,在6、12、24、48、72h SAH组与空白对照组、假手术组比较有显著统计学差异(P0.05),但在1h时间点SAH组与空白对照组、假手术组比较无显著统计学差异(P0.05)。(3)SAH组组内比较24h时间点凋亡最严重,与组内其他时间点比较有显著统计学差异(P0.05)。5.Western blot检测CHOP蛋白表达结果:(1)空白对照组、假手术组CHOP蛋白表达微弱,组间、组内在不同时间点比较无显著统计学差异(P0.05)。(2)SAH组CHOP蛋白表达与空白对照组、假手术组比较明显增多,SAH组6h CHOP蛋白表达开始上升,于24h达到峰值,然后逐渐下降,72h仍有较明显表达,第12、24、48、72hSAH组与对照组、假手术组比较有显著统计学差异(P0.05),但第1h、6h SAH组与对照组、假手术组比较无显著统计学差异(P0.05)。(3)SAH组内24h时间点CHOP蛋白表达最明显,与组内其他时间点比较有显著统计学差异(P0.05)。6.Western blot检测GRP78蛋白表达结果:(1)空白对照组、假手术组GRP78蛋白均表达微弱,组间、组内在不同时间点比较无显著统计学差异(P0.05)。(2)SAH组GRP78蛋白表达较空白对照组、假手术组明显增高,SAH后6h开始上升,于24 h达到峰值,然后逐渐下降,72 h表达仍较明显,第12h、24h、48h、72h SAH组与空白对照组、假手术组比较有显著统计学差异(P0.05),但在第1h、6h SAH组与对照组、假手术组比较无显著统计学差异(P0.05)。(3)SAH组内24h时间点GRP78蛋白表达最明显,与组内其他时间点比较有显著统计学差异(P0.05)。7.Western blot检测Caspase-12表达结果:(1)空白对照组、假手术组Caspase-12表达微弱,组间、组内不同时间点比较无显著统计学差异(P0.05)。(2)SAH组Caspase-12表达较空白对照组、假手术组明显增高,SAH后6h开始明显上升,于24h达到峰值,然后逐渐下降,72h仍有少量表达,第6h、12h、24h、48h、72h SAH组与空白对照组、假手术组比较有显著统计学差异(P0.05),第1h SAH组与对照组、假手术组比较无显著统计学差异(P0.05)。(3)SAH组内24h时间点表达最明显,与组内其他时间点比较有显著统计学差异(P0.05)。8.电镜观察结果:SAH组海马神经元凋亡比较严重,术后6h即可见细胞皱缩,体积变小,12h时胞质内空泡较多,细胞核体积变小,核膜下染色质边集、浓聚,呈现凋亡表现,24h时最为严重,可见细胞核裂解,凋亡小体形成。空白对照组及假手术组海马神经元及细胞器形态良好。9.根据Spearman相关性分析显示,SAH组大鼠的CHOP、GRP78和Caspase-12蛋白表达结果与脑水肿严重程度及神经元凋亡结果之间存在极显著正相关,与神经功能缺陷评分存在极显著负相关(P0.05)。其中在SAH后24h时间点表现最为明显。结论本研究表明:(一)在SAH后72h内CHOP、GRP78和Caspase-12表达均显著增高,说明SAH后确实发生了ER stress。(二)通过分析空白对照组、假手术组、SAH组的神经功能缺陷评分、脑水肿程度和神经元凋亡的差异,以及电镜下细胞及细胞器形态,说明在SAH早期确实发生了EBI。(三)证实了CHOP、GRP78和Caspase-12表达与EBI严重程度之间均存在正相关,初步揭示CHOP、GRP78和Caspase-12表达在SAH后EBI的病理过程中发挥了重要作用,其主要机制是SAH后过度激活的ER stress通过内质网相关性细胞凋亡(endoplasmic reticulum associated death,ERAD)途径造成了的大脑皮层神经元凋亡。(四)为今后深入研究SAH后EBI的发生机制及寻找针对性的治疗策略、潜在治疗靶点提供了理论依据。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R743.35
【图文】：

蛛网膜下腔,蛛网膜下腔出血,标本,血凝块

图I空白对照组大鼠脑组织标本:蛛网膜下腔无出血

蛛网膜下腔出血,标本,大鼠,血凝块

假手术组大鼠脑组织标本:29h时问点大鼠可有少

蛛网膜下腔出血,环池,视交叉,血凝块

穿刺原因部分可见少许蛛网膜下腔出血，但无血凝块（图２）邋；邋ＳＡＨ组大鼠取脑后在Ｗｉｌｌ邋ｉｓ逡逑环周围可见明显蛛网膜下腔积血，部分标本在视交叉池、环池、脚间池等脑池处可见较多逡逑血凝块（图３）。逡逑图１空白对照组大鼠脑组织标本：蛛网膜下腔无出血逡逑＿逡逑ｍｍ逡逑Ｍｍ逡逑图２假手术组大鼠脑组织标本：２４ｈ时间点大鼠可有少许蛛网膜下腔出血。逡逑灥＿逡逑ＨＡ逡逑图３邋ＳＡＨ组大鼠脑组织标本：ＳＡＨ组２４ｈ大鼠视交叉池环池等明显蛛网膜下腔出血，部分形成血凝块，逡逑严重者桥前池也可见明显蛛网膜下腔出血。逡逑２．２神经功能缺陷评分结果：逡逑（１）大鼠经水合氯醛溶液腹腔麻醉后ｌｈ未完全清醒，无法进行神经功能缺陷评分。一般逡逑３ｈ后大鼠逐渐恢复清醒，故从６邋ｈ开始评分。逡逑

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