免疫检查点分子Tim-3在胶质瘤发生发展中的作用及其分子机制研究

发布时间：2020-07-28 10:24

【摘要】：胶质瘤是神经外科临床工作中最常见的中枢神经系统原发性恶性肿瘤,因其浸润生长及周围累及大量神经纤维和核团的特点,手术完全切除十分困难,即使术后联合放射治疗疗及辅以替莫唑胺为主的化学治疗,其预后并不理想,复发率高,中位生存期仅约为14.6个月。随着对胶质瘤研究的不断深入,研究人员发现胶质瘤的肿瘤微环境在其生长侵袭和转移过程中起到很大作用,进而影响着患者的预后以及及肿瘤的复发。大量免疫细胞被胶质瘤驯化并募集到肿瘤组织中,能够分泌IL-10、TGF-β等细胞因子,抑制机体抗肿瘤免疫,因此被称之为抑制性免疫细胞。这些细胞促进胶质瘤细胞生长、侵袭,被公认为造成胶质瘤免疫逃逸的重要机制,也是限制目前胶质瘤常规治疗(手术、放疗和化疗)和以疫苗为代表的免疫治疗的重要原因。揭示胶质瘤免疫微环境形成机制,寻找逆转抑制性免疫微环境的有效手段成为今后胶质瘤治疗的新趋势。有文献报道,CTL、NK等效应细胞的表面可以表达一些抑制性受体,如CTLA-4、PD-1等,其与配体结合后可以产生抑制免疫效应细胞的过度活化的作用,被称之为免疫检查点。主要表现在肿瘤相关免疫细胞,尤其是CD8+T细胞及NK表面大量表达免疫抑制受体,因此被视为有效的肿瘤免疫治疗靶点。2013年基于免疫检查点干预的肿瘤免疫治疗新方法被评为Science十大科技进展榜首,2014年该方法被美国FDA批准进入临床,并在临床中取得了惊人疗效,比如,ipilimumab(针对CTLA-4的阻断性抗体)和pembroluzimab(针对PD-1的阻断性抗体)已经在晚期黑色素瘤、卵巢癌及非小细胞肺癌等多种肿瘤治疗中疗效显著,显著延长患者生存期。胶质瘤的免疫治疗也在同步进行,相关阻断性抗体也已进入Ⅱ-Ⅲ期临床实验中。近几年来,免疫检查点疗法连续入选十大创新新药及转化医学领域十大科技突破,受到世人瞩目,并成为肿瘤治疗领域的热点竞争领域。胶质瘤免疫抑制分子机制及免疫微环境的研究正成为胶质瘤免疫治疗的热点,新的免疫检查点分子不断被发现,未来胶质瘤免疫治疗将会有更多的选择。T细胞免疫球蛋白域黏蛋白域蛋白-3(T cell immunoglobulin domain,mucin domain 3,Tim-3)是2002年被鉴定的免疫调节分子,可表达于多种免疫细胞,在众多免疫生理和病理过程中调控机体固有免疫和适应性免疫功能。文献显示,Tim-3在NK细胞和CD8+ T细胞的功能耗竭以及增强Treg细胞的免疫抑制功能等过程中发挥了重要的作用,进而导致抑制性免疫微环境的形成,并且作为肿瘤免疫检查点疗法的重要候选靶点倍受关注。新近研究发现,胶质瘤患者外周血T细胞中Tim-3表达显著高于正常对照人群,且与肿瘤进程密切相关。基于以上前期研究结果和国内外进展,本课题深入探讨免疫调节分子Tim-3在胶质瘤发生发展中的生物学作用。课题通过临床标本检测和体外细胞实验发现,外周血免疫细胞中Tim-3表达与患者预后相关,而胶质瘤细胞中Tim-3表达可调控细胞生长和侵袭能力,参与肿瘤发生。[研究目的]1.分析外周血固有免疫细胞状态和Tim-3表达与胶质瘤进程的关系;2.研究胶质瘤细胞中Tim-3的表达及其在胶质瘤发生中的作用。[研究方法与结果]Ⅰ.外周血固有免疫细胞Tim-3表达异常与胶质瘤进程相关以免疫检查点分子为靶点的免疫治疗中是目前肿瘤生物治疗领域的热点。然而,单一检查点分子治疗存在副作用大,易出现耐受等问题,因此分析不同免疫检查点分子在肿瘤组织中的表达模式对于建立联合治疗策略具有重要的研究价值。Tim-3做为近年来倍受关注的免疫检查点分子,参与调控固有免疫和适应性免疫应答,已被报道与多种肿瘤的发生密切相关。有研究显示,胶质瘤患者外周血T细胞表面Tim-3表达显著升高。然而,固有免疫细胞中Tim-3表达与胶质瘤的关系尚未见报道。1-1胶质瘤患者外周血NK细胞比例降低为评价胶质瘤患者固有免疫应答状态,首先检测了外周血中固有免疫细胞(CD3-CD56+NK细胞,CD3+CD56+NKT细胞和CD14+单核细胞)的比例。流式结果显示,与正常人相比,胶质瘤患者外周血中NK细胞比例显著降低,而NKT细胞和单核细胞比例无显著差异。Ⅰ-2治疗后胶质瘤患者外周血NK细胞比例升高为进一步论证NK细胞比例降低与肿瘤发生的相关性,筛选回访患者中经过手术治疗联合放疗和/或常规化疗的患者,在完成全部治疗后3个月后,脑部CT显示肿瘤已完全消失。流式细胞术检测治疗前后胶质瘤患者外周血CD3-CD56+NK细胞,CD3+CD56+ NKT细胞和CD14+单核细胞比例,结果发现治疗后胶质瘤患者外周血NK细胞比例显著高于治疗前,且NKT细胞比例亦较治疗前显著升高,而单核细胞比例并无显著变化。Ⅰ-3胶质瘤患者NK细胞高表达Tim-3而IFN-γ产生降低已有研究报道,Tim-3参与调控固有免疫应答细胞的生存和功能。据此,我们检测了胶质瘤患者和正常对照人群外周血NK细胞、NKT细胞和单核细胞上Tim-3表达情况。流式细胞术结果显示,胶质瘤患者外周血NK细胞表面Tim-3表达显著高于正常人,而NKT细胞表面Tim-3表达无显著差异。进一步分析显示,胶质瘤患者中Tim-3+ NK细胞胞内IFN-γ的产生能力显著低于Tim-3-NK细胞。Ⅰ-4治疗前后胶质瘤患者外周血NK细胞Tim-3表达无显著变化为进一步论证NK细胞Tim-3表达与肿瘤发生的相关性,流式细胞术检测治疗前后胶质瘤患者CD3-CD56+ NK细胞和CD3+CD56+ NKT细胞中Tim-3表达情况。流式细胞术结果显示,治疗前后胶质瘤患者外周血NK细胞和NKT细胞中Tim-3比例以及平均荧光强度(MFI)并无显著差异。Ⅰ-5胶质瘤患者单核细胞高表达Tim-3且具有M2样表型单核细胞是固有免疫系统的重要组成,而Tim-3参与调控单核细胞活化和功能。因此,课题研究了胶质瘤患者外周血单核细胞表面Tim-3的表达情况,并分析与单核细胞活化表型的相关性。流式细胞术结果显示,胶质瘤患者外周血单核细胞Tim-3表达显著高于正常人。更为重要的是,具有M2样表型的单核细胞(CD206+CD14+细胞)较CD206-CD14+细胞表达更高水平的Tim-3。以上结果提示,Tim-3在单核细胞中的表达与其表型具有相关性。1-6治疗前后胶质瘤患者外周血单核细胞Tim-3表达无显著变化为进一步论证单核细胞Tim-3表达与肿瘤发生的相关性,流式细胞术检测治疗前后胶质瘤患者CD14+T细胞中Tim-3表达情况。流式细胞术结果显示,治疗前后胶质瘤患者外周血单核细胞中Tim-3比例以及平均荧光强度(MFI)并无显著差异。1-7 NK细胞和单核细胞上Tim-3表达与胶质瘤细胞的增殖指数相关已有研究显示,免疫细胞上Tim-3表达参与肿瘤进程。因此,课题分析了NK细胞和单核细胞上Tim-3表达与胶质瘤细胞增殖的相关性。免疫组化和统计学分析结果显示,胶质瘤组织中Ki-6阳性率较高(Ki-6715%)的患者外周血NK细胞和单核细胞表达更高水平的Tim-3,反之亦然。Ⅰ-8单核细胞Tim-3表达与胶质瘤患者预后相关为进一步评价外周血中Tim-3表达的临床意义,课题分析了胶质瘤患者NK细胞和单核细胞Tim-3表达与生存期的相关性。统计学结果显示,单核细胞高表达Tim-3的患者复发或死亡的风险高于低表达Tim-3患者,而NK细胞上Tim-3表达与患者预后无明显相关系。该结果提示,单核细胞中Tiim-3表达可作为胶质瘤患者预后评价的潜在指标。Ⅱ.胶质瘤细胞Tim-3表达的临床意义和生物学功能新近研究显示,Tim-3尚可表达于免疫细胞之外的其他组织细胞,如肿瘤细胞,参与疾病的发生发展进程。然而,胶质瘤细胞中Tim-3的表达情况及其生物学功能尚未见报道。因此,本课题分析了胶质瘤组织中Tim-3表达的临床意义,并初步探讨了其生物学功能。Ⅱ-1 Tim-3可异位表达于胶质瘤细胞课题首先检测了胶质瘤组织与正常组织中Tim-3的表达情况。免疫组化结果显示,胶质瘤组织中Tim-3表达阳性的细胞比例显著升高。免疫荧光的结果亦进一步证实,胶质瘤组织中除在免疫细胞中可检测到Tim-3的表达外,胶质瘤细胞中亦可检测到明显的Tim-3阳性表达。Ⅱ-2胶质瘤组织中Tim-3表达显著升高利用TCGA数据库,进一步分析了不同组织分型的胶质瘤与正常脑组织中Tim-3的表达差异。统计学分析显示,与正常脑组织相比,各类型胶质瘤组中Tim-3表达均有升高的趋势,其中胶质母细胞瘤、星型胶质细胞瘤和未分类型胶质细胞瘤尤为显著。此外,课题还分析了 Tim-3表达与胶质瘤分子亚型的相关性,统计学结果显示,间质型胶质瘤表达最高,显著高于经典型胶质瘤、神经元型胶质瘤和前神经元型胶质瘤,而经典型胶质瘤亦显著高于前神经元型胶质瘤。Ⅱ-3 Tim-3表达与胶质瘤分级和患者生存期密切相关免疫检查点分子在肿瘤发生发展中发挥重要作用,为评价Tim-3表达的生物学意义,课题进一步探讨了 Tim-3表达与肿瘤病理分级的相关性。统计学分析结果显示,尽管Ⅰ～Ⅲ级胶质瘤间Tim-3表达无显著性差异,Ⅳ级胶质瘤中Tim-3表达却显著升高。生存期分析显示,Tim-3高表达患者生存期显著低于低表达者,相对于Tim-3低表达组,Tim-3高表达组生存率的HR值为0.39。Ⅱ-4 Tim-3可促进胶质瘤细胞增殖肿瘤细胞的恶性增殖是恶性肿瘤的重要特征。因此,课题利用体外实验,首先检测了 Tim-3干扰对胶质瘤细胞系U251生长增殖的影响。CCK-8结果显示,与对照组相比,干扰Tim-3表达,可显著抑制U251细胞的生长和集落形成能力。细胞周期分析显示,Tim-3敲减可组织U251细胞在G0/G1期。Western blot结果亦显示,Tim-3干扰组细胞周期蛋白Cyclin D1和增殖相关蛋白c-Myc表达有下调趋势,而凋亡相关cleaved PARP表达有升高趋势。Ⅱ-5 Tim-3可促进胶质瘤细胞侵袭能力胶质瘤细胞的侵袭转移能力是导致患者复发、预后差的主要机制。因此,课题检测了肿瘤细胞Tim-3表达对其侵袭能力的影响。Transwell结果显示,干扰Tim-3表达可显著抑制胶质瘤细胞的侵袭能力。Western blot进一步提示,Tim-3干扰可下调EMT相关marker(N-Cadherin)的表达。以上结果提示,Tim-3可能通过影响肿瘤细胞侵袭转移能力,参与胶质瘤发生。[研究结论及意义]1.本研究首次检测并分析了胶质瘤患者外周血固有免疫细胞(NK细胞,NKT细胞和单核细胞)中Tim-3表达及其与固有免疫功能状态、肿瘤增殖状态和患者预后的相关性,将为胶质瘤的诊断和预后判断提供新的靶点。2.本课题发现了 Tim-3在胶质瘤细胞中存在内源性表达,与肿瘤组织分型、分子分型、病理分级和生存期密切相关,且可直接促进肿瘤细胞增殖和侵袭,将为以Tim-3为靶点的胶质瘤免疫治疗提供新依据。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.41
【图文】：

细胞,比例,胶质瘤,流式细胞术

ＮＫＴ细胞，ＣＤ１４＋单核细胞和ＣＤ３－ＣＤ５６＋邋ＮＫ细胞为代表的固有免疫细胞的比逡逑例，并以健康查体志愿者作为对照。荧光标记ＣＤ３、ＣＤ５６和ＣＤ１４抗体对外周逡逑血单个核细胞进行表面染色，流式结果显示（图１），与对照组相比，研宄组患逡逑者外周血中ＮＫ细胞比例显著降低，而ＮＫＴ细胞和单核细胞比例却无显著差异。逡逑因此可以推测ＮＫ细胞比例降低可能与胶质瘤发生发展有相关性。逡逑３０逡逑

脑部,胶质瘤,治疗前后,患者

为进一步论证ＮＫ细胞比例降低与肿瘤发生的相关性，筛选回访患者中经过逡逑手术治疗联合放疗和／或常规化疗的患者，在完成全部治疗后３个月后，脑部ＭＲＩ逡逑显示肿瘤己完全消失（图２）。逡逑ＩＨＥ：邋Ｊ逡逑ＩＢ逡逑图２胶质瘤患者治疗前后脑部ＭＲＩ结果。（Ａ－Ｄ）患者术前显示左侧额叶逡逑长Ｔ１长Ｔ２占位性病变，周围水肿明显，增强扫描，病变不均匀强化；（Ｅ－Ｈ）逡逑患者术后行同步放化疗后复查，发现未见明显病变残留。逡逑Ｆｉｇ．邋２邋ＭＲＩ邋ｉｍａｇｉｎｇ邋ｉｎ邋ｇｌｉｏｍａ邋ｐａｔｉｅｎｔｓ邋ｂｅｆｏｒｅ邋ａｎｄ邋ａｆｔｅｒ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．邋（Ａ－Ｄ）逡逑Ｔｈｅｒｅ邋ｗａｓ邋ａ邋ｌｏｎｇ邋Ｔ１邋ａｎｄ邋ｌｏｎｇ邋Ｔ２邋ｓｉｇｎａｌ邋ｏｃｃｕｐｙｉｎｇ邋ｌｅｓｉｏｎ邋ｉｎ邋ｌｅｆｔ邋ｆｒｏｎｔａｌ邋ｌｏｂｅ邋ｗｉｔｈ逡逑ｏｂｖｉｏｕｓ邋ｅｄｅｍａ邋ａｒｏｕｎｄ邋ｉｔ邋ａｎｄ邋ｉｎｌｉｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ邋ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ；邋（Ｅ－Ｈ）邋Ｔｈｅｒｅ邋ｗａｓ邋ｎｏ逡逑ｏｂｖｉｏｕｓ邋ｒｅｓｉｄｕａｌ邋ｌｅｓｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｎｏ邋ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ邋ａｆｔｅｒ邋ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ邋ｃｈｅｍｏｍｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ．逡逑术后随访的患者留取外周血，并分离外周血中单个核细胞，运用流式细胞术逡逑检测胶质瘤患者治疗前后ＣＤ３－ＣＤ５６＋邋ＮＫ细胞，ＣＤ３＋ＣＤ５６＋邋ＮＫＴ细胞和ＣＤ１４＋逡逑单核细胞比例。流式细胞术结果显示（图３）

外周血,胶质瘤,细胞,患者

术后随访的患者留取外周血，并分离外周血中单个核细胞，运用流式细胞术逡逑检测胶质瘤患者治疗前后ＣＤ３－ＣＤ５６＋邋ＮＫ细胞，ＣＤ３＋ＣＤ５６＋邋ＮＫＴ细胞和ＣＤ１４＋逡逑单核细胞比例。流式细胞术结果显示（图３），胶质瘤患者外周血ＮＫ细胞比例逡逑３２逡逑

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