营养竞争微环境下PKM2在胶质瘤增殖侵袭和免疫抑制中的作用

发布时间：2020-07-29 10:30

【摘要】：研究目的:恶性胶质瘤(malignant glioma,MG)是中枢神经系统最常见的原发恶性肿瘤,具有异常增殖、广泛浸润、高度异质、放化疗抵抗等特点。胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)是最具典型特征的恶性胶质瘤。越来越多的证据支持癌症是代谢紊乱性疾病,存在特异的代谢重构。目前现有的治疗手段近二十年来未能明显改善GBM的生存期,仅有限推进,免疫治疗带来了希望。有氧糖酵解是GBM代谢改变的一个显著特征,同时也是免疫细胞快速反应所必须。肿瘤微环境中肿瘤细胞和免疫细胞的代谢竞争为寻求治疗靶点提供了机会。丙酮酸激酶M2型(Pyruvate Kinase M2,PKM2)在有氧糖酵解中发挥关键作用,是细胞糖酵解途径末端的关键限速酶。本研究探究PKM2在胶质瘤中的分布和表达规律,在肿瘤细胞增殖和侵袭中所起的作用。抑制肿瘤细胞的PKM2表达对肿瘤生长和原位种植肿瘤荷瘤鼠生存期的影响,能否减缓肿瘤微环境中的免疫抑制状态,本课题进行了初步的研究。研究方法:采用生物信息学的分析方法,通过MERAV、Oncomine、Murat Brain、Sun Brian数据库,对人类正常各部位组织和不同肿瘤组织中PKM2的表达进行对比分析,并着重分析对照脑组织和各级别胶质瘤中PKM2的表达差异。进一步利用TCGA和CGGA数据库对不同病理级别中PKM2的转录及相关通路的关键分子进行分析,总结其特点。在TCGA数据库,分析GBM中各种免疫细胞的存在与患者预后的关系。细胞荧光、免疫组织化学染色、免疫荧光、Western blot实验检测不同级别脑胶质瘤肿瘤切除标本、胶质母细胞瘤细胞系中PKM2的表达情况。构建GL261细胞系C57BL/6小鼠鼠脑原位种植模型及皮下种植模型,敲低PKM2对肿瘤生长和颅内荷瘤鼠生存期的影响,比较对照组和敲低组中肿瘤组织表达CD163、PD-L1的差异。研究结果:PKM2在常见的肿瘤中高表达,在快速反应的免疫细胞也表达。在TCGA数据库中,PKM2的表达和胶质瘤患者的预后相关。PKM2表达于胶质瘤细胞系、胶质瘤肿瘤组织。PKM2在各级别胶质瘤中均有所表达,随着级别增高,表达增强。敲低PKM2的表达能抑制肿瘤细胞的增殖,但却增强了肿瘤细胞的侵袭能力,可能的机制是氧化磷酸化增强,启动了下游骨架蛋白的表达。GL261细胞系C57BL/6小鼠鼠脑原位种植模型显示,敲低PKM2能抑制肿瘤的生长,延长荷瘤鼠的生存期。相关于对照组,PKM2敲低组肿瘤标本中CD163、PD-L1的表达减少,推测由于乳酸的产生减少,使得肿瘤相关巨噬细胞M2亚型细胞生成的减少,PD-L1的表达减弱能减缓能对T杀伤细胞的抑制,从而能解除肿瘤微环境中部分免疫抑制作用。结论:PKM2是有氧糖酵解的关键限速酶,在恶性胶质瘤中高表达,随着级别升高,表达增强。PKM2的异常表达促进了肿瘤的进展,抑制PKM2的表达能抑制肿瘤细胞增殖,但促进了肿瘤细胞的侵袭能力。动物模型实验提示抑制PKM2能减缓肿瘤的生长,延长颅内荷瘤鼠的生存期。抑制PKM2后,肿瘤组织中肿瘤相关巨噬细胞M2亚型减少,肿瘤细胞表达PD-L1减少,能减缓微环境中的免疫抑制状态,涉及的复杂机制尚需进一步研究。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.4
【图文】：

天津医科大学博士学位论文图 1.2 TCGA 和 CGGA 数据库显示 PKM2 在不同级别胶质瘤中的表达情况及与预后的关系。PKM2 在高级别胶质瘤中高表达，在间质型中表达相对其他类型升高。PKM2 的表达升高，生存期相对缩短，提示与预后相关。1.2.3 数据库组织芯片提示 PKM2 的表达情况数据库组织芯片免疫组化化学染色，提示低级别胶质瘤和高级别胶质瘤均表达 PKM2 蛋白，但高级别胶质瘤异常高表达 PKM2 蛋白，提示与级别有相关性（如图 1.3）。

图 1.4 PKM2 在单中心收集的各级别胶质瘤中的表达特征。PKM2 在低级别胶质瘤中表达较弱，高级别胶质瘤中表达增强，随着级别的升高，表达增强（图×200）。1.2.5 PKM2 在胶质瘤细胞系中的表达规律对常见的胶质瘤细胞系进行了 PKM2 的免疫荧光检测，发现 GL261、U87、U251及 LN229 中均表达 PKM2，荧光强度较高，各细胞系间的表达无明显差异，以 GL261细胞为例（如图 1.5）。

图 1.4 PKM2 在单中心收集的各级别胶质瘤中的表达特征。PKM2 在低级别胶质瘤中表达较弱，高级别胶质瘤中表达增强，随着级别的升高，表达增强（图×200）1.2.5 PKM2 在胶质瘤细胞系中的表达规律对常见的胶质瘤细胞系进行了 PKM2 的免疫荧光检测，发现 GL261、U87、U25及 LN229 中均表达 PKM2，荧光强度较高，各细胞系间的表达无明显差异，以 GL26细胞为例（如图 1.5）。

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本文编号：2773840