胶质瘤患者HCMV感染、表达及其IE1基因对U251细胞株生物特性的影响

发布时间：2020-08-03 17:13

【摘要】：人神经胶质瘤是目前已知的恶性程度最高的中枢神经系统肿瘤,也是发病率较高的颅内恶性肿瘤。然而,由于神经胶质瘤恶性程度高,胶质瘤细胞有很强的增殖能力、迁移和侵袭能力、抗凋亡能力,且胶质瘤组织与周围组织分界不清,呈浸润性生长,手术治疗很难完整切除。尽管现在医疗技术非常发达,但神经胶质瘤的治疗效果仍没有显著提升,即使采用手术、化疗、放射疗法结合,其死亡率仍居高不下。因此,发现神经胶质瘤患者具有预防、诊断和治疗意义的分子靶点,对于监测和改善其恶性生物学行为具有重要的科学和临床意义。近年来,越来越多的研究显示,神经胶质瘤患者中存在人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染,及其病毒DNA和蛋白的表达,提示HCMV可能与神经胶质瘤的发生和发展存在某种联系。此外,HCMV基因产物激活多种细胞因子,可促进肿瘤的演进和血管生成,如感染早期病毒IE1基因过表达能促进肿瘤的侵袭和转移,促进胶质瘤的发展。还有研究结果显示,由于HCMV能刺激细胞生长因子的过度表达、激活原癌基因、抑制抑癌基因产物、感染细胞调控机制、增加细胞恶性特征的表达,因而在胶质瘤的发生和发展中起重要作用。基于此,本研究检测HCMV DNA、抗体,分析HCMV立刻早期基因1-72(IE1-72)蛋白和磷酸化糖蛋白65(pp65)在胶质瘤组织中表达水平,探讨IE1-72和pp65蛋白表达水平和神经胶质瘤临床病理学特征的关系,并进一步采用体外实验技术,构建IE1表达载体,成功转染入神经胶质瘤U251细胞株,观察细胞内IE1 mRNA的表达;再分别检测IE1过表达后,U251细胞的增殖、迁移、侵袭和抗凋亡能力的变化。目的分析神经胶质瘤患者、外伤颅脑出血患者脑组织中HCMV抗原和核酸及外周血标本HCMV IgG和IgM抗体阳性率,观察HCMV IE1对神经胶质瘤细胞生物学特性的影响,探讨HCMV与神经胶质瘤的相关性。方法随机收集39例脑胶质瘤患者瘤组织标本及血液标本为实验组(按照WTO病理学分级标准对瘤组织分类:I级星形细胞瘤3例,II级6例,III级16例,IV级14例),收集9例外伤颅脑出血外伤颅脑出血患者的脑组织标本及血液标本为对照组。(1)取患者血液标本,密度梯度离心分离外周血淋巴细胞,检测淋巴细胞HCMV pp65抗原,ELISA方法检测血清中HCMV IgG和IgM抗体,分别计算实验组及对照组的抗原、抗体阳性率。(2)巢式PCR检测技术检测两组组织标本和外周血中HCMV DNA中HCMV UL55基因,荧光定量PCR检测其中HCMV DNA的拷贝数。(3)采用免疫组织化学实验方法分析HCMV IE1-72和pp65抗原在神经胶质瘤组织中的表达水平。(4)构建携带HCMV IE1基因的质粒pCDNA3.0-IE1,转染神经胶质瘤细胞株U125,筛选出成功转染细胞株,设为设HCMV IE1(U251-IE1)组,与细胞对照组和空质粒对照组作比较,观察转染HCMV IE1基因后神经胶质瘤U251-IE1生物学特性的变化;包括细胞增殖检测(CCK-8试剂盒法)实验,观察转染HCMV IE1对神经胶质瘤细胞增殖能力的影响,通过流式细胞术检测细胞凋亡情况,分析转染HCMV IE1基因后,是否影响神经胶质瘤细胞抗凋亡作用,细胞划痕实验和Transwell实验分析转染HCMV IE1对神经胶质瘤细胞迁移及侵袭能力的影响。结果(1)外周血HCMV-IgG、IgM抗体检测结果:39例神经胶质瘤患者外周血抗原血症检测结果均为阴性;36例患者(36/39,92.3%)HCMV IgG抗体阳性,显著高于对照组(χ~2=33.2,P0.01);7例(7/39,17.9%)HCMV IgM抗体阳性,与对照组无显著差异(χ~2=1.89,P0.05);对照组9例IgG抗体及IgM抗体均阴性。胶质瘤组织和外周血中抗人巨细胞病毒IgM阳性率与病毒DNA拷贝数呈显著正相关(r=0.76,P0.01)。HCMV IgM阳性患者的神经胶质瘤组织HCMV IE1-72和pp65抗原蛋白均阳性;3例HCMV IgG阴性患者的血液及瘤组织HCMV DNA结果阴性。(2)实验组胶质瘤组织标本及外周血HCMV DNA实验结果:实验组25例(25/39,64.1%)患者瘤组织细胞检出HCMV UL55基因,其中I、II、III、IV级星形细胞瘤的阳性率分别为66.7%(2/3)、50%(3/6)、68.8%(11/16)、64.3%(9/14);25例基因阳性患者中23例神经胶质瘤组织的IE1-72和pp65蛋白抗原均为阳性,另2例HCMV DNA检测阳性的神经胶质瘤组织IE1-72和pp65阴性。同时,有5例IE1-72阳性的标本未检出HCMV DNA。对照组9例外伤颅脑出血患者的脑组织中均未检出HCMV DNA。巢式PCR技术检测胶质瘤20例(20/39,51.3%)患者外周血HCMV DNA阳性,其中I、II、III、IV级星形细胞瘤的阳性率分别为66.7%(2/3)、33.3%(2/6)、50%(8/16)57.1%(8/14)。外周血HCMV DNA阳性率与脑胶质瘤组织中HCMV的检出无显著相关性;5例患者外周血HCMV DNA检测阴性,而神经胶质瘤组织HCMV DNA均检出为阳性。DNA测序证实所有PCR扩增产物的序列与HCMV UL55完全一致。在神经胶质瘤每500ng组织中及外周血液中平均log10 HCMV DNA拷贝数分别为(3.75±1.60)、(2.88±1.20),对照组分别为(1.66±0.19)、(1.54±0.12);实验组胶质瘤组织标本及血液标本HCMV DNA阳性率均显著高于对照组(P0.01),在神经胶质瘤组织和外周血中HCMV DNA拷贝数均低于典型的活动性感染时HCMV DNA拷贝数(平均log10 HCMV DNA拷贝数为9.507)。(3)组织标本免疫组化检测结果:实验组共有30例(30/39,76.9%)神经胶质瘤患者瘤组织HCMV IE1-72为阳性,其中I、II、III、IV级星形细胞瘤的阳性率分别为66.7%(2/3)、83.3%(5/6)、75.0%(12/16)、78.6%(11/14);26例(26/39,66.7%)神经胶质瘤患者瘤组织HCMV pp65阳性,其中I、II、III、IV级星形细胞瘤的阳性率分别为66.7%(2/3)、66.7%(4/6)、56.3%(9/16)、78.6%(11/14)。其中26例pp65阳性标本其IE1-72均为阳性,30例IE1-72阳性的标本中4例为pp65阴性;而对照组9例外伤颅脑出血患者脑组织HCMV IE72和pp65抗原均阴性;实验组HCMV IE1-72及PP65阳性率均显著高于对照组(P0.01)。(4)HCMV IE1对神经胶质瘤细胞生物学特性的影响:向U251细胞内转染HCMV IE基因后筛选成功转染细胞株,CCk-8法实验结果显示转染HCMV IE1基因后U251细胞的增殖能力较空质粒对照组和细胞对照组显著增强(P0.05),而空质粒对照组和细胞对照组细胞的增殖能力无显著性差异,表明HCMV IE1基因具有促进神经胶质瘤细胞增殖的能力;流式细胞术分析转染HCMV IE1组、空质粒对照组和细胞对照组细胞的凋亡水平发现转染HCMV IE1基因后U251细胞的抗凋亡能力较空质粒对照组和细胞对照组显著增强,而空质粒对照组和细胞对照组细胞无显著性差异,表明HCMV IE1基因能显著抑制神经胶质瘤细胞凋亡;Transwell实验分析转染HCMV IE1组、空质粒对照组和细胞对照组细胞的迁移和侵袭能力发现转染HCMV IE1基因后U251细胞的迁移和侵袭能力较空质粒对照组和细胞对照组显著增强(P0.01),而空质粒对照组和细胞对照组细胞无显著性差异;划痕实验结果显示转染HCMV-IE1后U251细胞株迁移能力显著增强(P0.01)。结论HCMV感染与神经胶质瘤存在相关性,HCMV可能通过IE1等多种分子信号途径参与神经胶质瘤的发生和发展。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.4
【图文】：

抗体,胶质瘤,阴性,检出率

图 1 CMV pp65 抗原血症检测结果A：阳性对照玻片的检出结果；B：阴性 CMV pp65 检测结果Fig 1. The result of CMV pp65 antigenic testA: Positive control test results of slides; B: Negative test results of CMV pp652.2 血清抗 HCMV IgG、IgM 抗体检测结果在 39 例胶质瘤患者中，有 36 例（92.3%）抗 HCMV IgG 抗体阳性，7 例（17.9%）抗 HCMV IgM 抗体阳性（表 1 和表 2）；对照组 9 例 IgG 抗体及 IgM 抗体均阴性；实验组 IgG 抗体（χ2=33.2，P<0.01）检出率明显高于对照组；两组间 IgM 抗体检出率无显著性差异（χ2=1.89，P>0.05）。胶质瘤组织病毒 DNA 拷贝数和外周血中抗人巨细胞病毒 IgM 阳性程度呈显著正相关（r=0.76，p<0.01）。HCMV IE72 和 pp65抗原均能够在 HCMV IgM 阳性的神经胶质瘤组织中检出。在 3 例 HCMV IgG 阴性

外周血,水平检测,胶质瘤,神经胶质瘤

图 2 胶质瘤及外周血患者中 HCMV DNA 水平检测结果A、B：在 25 例胶质瘤组织和 20 例外周血标本中检测到 HCMV DNA；C：UL55 PCR 产物的部分测序结果Fig 2. Nested PCR demonstrates that HCMV DNA UL55 gene exists in tumor tissue andperipheral blood of glioma patients.A and B: HCMV DNA was detected in 25 glioma tissues and 20 peripheral blood samples. C:partial sequencing results of UL55 PCR products2.2 神经胶质瘤组织和外周血中 HCMV DNA 载量通过荧光定量 PCR 扩增 UL123 外显子 4 的 100 bp 区域来确定神经胶质瘤组织及外周血中 HCMV DNA 的载量。在神经胶质瘤组织中每 500 ng 的总 DNA 平均log10 HCMV DNA 拷贝数为 3.75±1.60，在外周血中每 500 ng 的总 DNA 平均 log10

拷贝数,外周血,胶质瘤,神经胶质瘤

安徽医科大学博士学位论文NA 拷贝数为 2.88±1.209，瘤组织 HCMV DNA 含量明显高001）（见图 3）；对照组分别为(1.66±0.19)、(1.54±0.12)；实验P<0.01）在神经胶质瘤组织和外周血中 HCMV DNA 拷贝数均染时 HCMV DNA 拷贝数（平均 log10 HCMV DNA 拷贝数为 PCR 共 25 例样本 HCMV DNA 结果阳性，对照组均为阴性量结果（log10 HCMV DNA 拷贝数为 4.76±1.05）显著高于阴量（1.96±0.18）（P<0.01）。

【参考文献】