炎症抑制剂PTUPB和长链非编码RNA HMMR-AS1影响胶质母细胞瘤生长的机制研究

发布时间：2020-08-07 00:20

【摘要】：工作目的胶质母细胞瘤(GBM)是成人常见的原发性高度恶性中枢神经系统肿瘤(WHO Ⅳ级),即使联合使用当前最先进的治疗手段,其预后仍然很不乐观。当前迫切需要继续在细胞和分子生物学水平上对GBM进行深入的研究以取得突破。炎症反应能改变肿瘤微环境,通过多种活性因子促进肿瘤的血管生成、细胞增殖和侵袭转移。有研究认为,成人大脑的室管膜下区(SVZ)因临近侧脑室受到脑脊液中炎症诱导因子的影响而存在持续的炎症反应,存在于SVZ的神经干细胞和祖细胞在炎症反应产生的多种活性因子(包括多种生长因子、细胞因子和趋化因子)的持续刺激下会转变成具有致瘤能力的肿瘤干细胞,而这些肿瘤干细胞可能是导致包括GBM在内的脑部肿瘤的根源。因此,抑制炎症反应或许不仅可以从根源上遏止GBM的发生,还能通过抑制肿瘤血管生成和细胞增殖抑制GBM的发展。长链非编码RNA(lncRNA)在包括GBM在内的很多恶性肿瘤中都呈异常表达,与肿瘤的发生、转移以及恶性进展等密切相关。调控炎症反应和lncRNA都会对肿瘤的发生发展产生深远的影响。本研究的目的在于,分析炎症抑制剂对lncRNA及相关基因表达谱的改变,探索抑制炎症反应和调控相关lncRNA对GBM的影响和机制。研究方法1.使用Arraystar人类LncRNA芯片V3.0芯片对样品进行微阵列基因芯片检测分析。使用 Agilent DNA Microarray Scanner(part number G2505C)进行芯片扫描,使用Agilent Feature Extraction软件(v11.0.1.1)采集芯片探针信号值,使用Agilent GeneSpring GX v12.1软件进行芯片标准化、挑选差异表达的lncRNA 和 mRNA。2.设计并合成针对HMMR和HMMR-AS1的siRNA或者构建搭载HMMR和HMMR-AS1的shRNA的慢病毒载体,分别对细胞进行瞬时或者稳定转染下调HMMR和HMMR-AS1表达;合成HMMR和HMMR-AS 1全长序列,构建慢病毒载体稳定转染细胞,使HMMR和HMMR-AS1过表达。3.使用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法检测细胞增殖或者细胞存活情况。4.使用transwell小室(8μm孔径)检测细胞迁移和侵袭能力。5.用FACS Calibur流式细胞仪检测细胞周期情况。6.利用Applied Biosystems公司的TaqmanTM检测试剂盒,在AB17300系统上完成实时定量PCR检测,用于评估相关基因的转录水平。7.使用免疫印记实验或细胞免疫荧光实验检测细胞内蛋白的表达情况。8.构建裸小鼠GBM颅内移植瘤模型或者裸小鼠GBM皮下移植瘤模型,从体内水平观察GBM生长情况。9.用免疫组织化学染色评估裸小鼠移植瘤组织的相关蛋白表达情况。10.使用 SPSS、GraphPad Prism、Microsoft Excel 和 ImageJ 等软件对数据进行分析。结果1.炎症抑制剂t-AUCB(sEH特异性抑制剂)导致U87细胞605个lncRNA和689个mRNA的表达出现了明显变化(Fold Change≥2.0,P0.05),其中375个lncRNA和338个mRNA表达上调,230个lncRNA和351个mRNA表达下调。2.t-AUCB所致差异表达的反义lncRNA中HMMR-AS1的下调幅度最大(Fold Change=6.47,P=0.031),其正义转录本HMMR mRNA也显著下调。3.HMMR-AS1在GBM肿瘤组织和细胞系中都呈高表达。4.下调HMMR-AS1能导致细胞周期G1期阻滞、抑制细胞迁移和侵袭。5.体外和体内研究结果都显示,下调HMMR-AS1后GBM细胞中HMMR表达水平降低、GBM细胞生长受抑制。6.下调HMMR-AS1能使GBM对X射线的放射治疗更敏感。7.上调HMMR-AS 1使c-Myc水平升高但不影响HMMR的表达。8.HMMR-AS1可以维持HMMR mRNA的稳定性。9.体外和体内研究结果都显示,上调HMMR-AS1能促进GBM生长。10.因GBM通过上调COX-2抵抗t-AUCB,导致在体内水平t-AUCB对GBM抑制效果不佳,所以用COX-2/sEH双靶点抑制剂PTUPB替换t-AUCB继续研究。在体外水平,PTUPB显著抑制GBM细胞增殖、导致细胞周期G1期阻滞、下调HMMR-AS1和HMMR的表达水平、抑制干细胞标记物的表达、下调磷酸化EGFR的水平。11.体内水平研究证实,PTUPB抑制GBM血管生成和肿瘤生长、抑制HMMR表达。12.一些对GBM生长有促进作用的调控因子,例如HMMR、ERK1/2、c-Myc、CDK2、CDK4、BMIl、CyclinD1 和 ZEB1 受到了 PTUPB 和 HMMR-AS1 的共同调控。结论1.下调HMMR-AS1不仅能抑制GBM肿瘤生长、迁移和侵袭,还能增强GBM对放射线的敏感性;上调HMMR-AS1通过调控癌基因c-Myc的表达促进GBM肿瘤的生长。这为以lncRNA作为靶点治疗GBM提供了强有力的证据。2.PTUPB对GBM具有显著抑制作用,并且可以特异性抑制COX-2和sEH两个靶点,或将为临床上进行GBM靶向治疗提供新的思路。3.一些对GBM生长有促进作用的蛋白受到了 PTUPB和HMMR-AS1的共同调控,说明炎症反应和lncRNA之间的相互作用对GBM的发生发展具有重要影响,对两者之间的复杂联系进行深入探索,或将为GBM的分子生物学诊断和靶向治疗提供很有价值的线索。
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.4
【图文】：

图１．３：反义方向上的转录事件发生时，与正义方向上ｍＲＮＡ的转录发生冲突、抑制正义逡逑

图１．５：细胞核内的ｉｌ：义－反义ＲＮＡ互补形成双链ＲＮＡ，图片引向参考文献［２３］逡逑

图１．６：细胞质内正义－反义双链ＲＮＡ的形成，图片引自参考文献［２３］

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本文编号：2783176