RIZ1通过c-Myc负向调控UbcH10在恶性脑膜瘤中的作用与机制研究

发布时间：2020-08-07 05:46

【摘要】：脑膜瘤是最常见的中枢神经系统肿瘤之一,其发病率约占颅内所有原发肿瘤的15-25%。根据2016年世界卫生组织(WHO)公布的最新病理分级,脑膜瘤可分为WHO Ⅰ、WHO Ⅱ和WHO Ⅲ三个级别。其中WHO Ⅱ和WHO Ⅲ级脑膜瘤较WHO Ⅰ级增殖活跃,复发率高且预后不佳。手术治疗是针对高级别脑膜瘤首选的治疗方式,但是影响其复发的因素及后续的治疗选择也较低级别脑膜瘤更加复杂。在过去的几十年中,外科技术、放射治疗技术、药物治疗方面都取得了很多进步,高级别脑膜瘤的整体生存率也略有改善,但是,仍然需要更多的前瞻性数据。目前,世界上有大量的基于微创技术和分子靶向治疗技术发展的临床试验,试图获取治疗高级别脑膜瘤的新的突破,因此,深入研究恶性脑膜瘤增殖失控的具体机制,寻找影响脑膜瘤发生发展的可靠的关键靶标就显得更加迫切,这些研究都将为后续临床干预脑膜瘤提供理论和实验支撑。视网膜母细胞瘤蛋白质结合的锌指蛋白1 (RIZ1)定位于1p36,目前被认为是一种重要的抑癌基因。最近的研究表明,该基因在胶质瘤、乳腺癌、肝癌、结肠癌等肿瘤的发生发展中发挥重要作用。我们前期研究中发现,RIZ1基因蛋白水平与脑膜瘤的病理分级呈负相关,而在恶性脑膜瘤细胞系IOMM-Lee中过表达RIZ1可抑制细胞的增殖并使细胞发生G2/M期阻滞,并且能够进一步促进细胞凋亡。更深入的研究表明,过表达RIZ1能降低c-Myc的表达。UbcH10是泛素结合酶家族的重要成员,其异常高表达具有致癌作用。我们前期研究发现,UbcH10在脑膜瘤组织中的表达与脑膜瘤的病理分级正相关,且高表达的UbcH10提示了更差的预后。另外还发现c-Myc的过度表达可促进UbcH10的表达。因此,我们推测,RIZ1是否通过c-Myc调控UbcH10使脑膜瘤保持恶性增殖,而这其中的具体机制尚不了解。本实验首先从手术切除的新鲜脑膜瘤组织标本中培养并鉴定了 2株间变性(WHO Ⅲ级)脑膜瘤原代细胞,通过免疫组化和过表达实验探讨了 RIZ1和UbcH10的上下游关系,然后通过体外细胞实验,观察了 UbcH10在恶性脑膜瘤细胞中的生物学功能。最后,通过染色质免疫共沉淀(ChIP)和双荧光素酶报告基因实验明确RIZ1依赖c-Myc调控UbcH10的具体机制。本研究共分为四个部分。第一部分:恶性脑膜瘤原代细胞的培养和鉴定;第二部分:RIZ1和UbcH10上下游关系的研究;第三部分:敲低UbcH10的表达对恶性脑膜瘤原代细胞功能的影响;第四部分:RIZ1通过c-Myc调控UbcH10的机制研究。第一部分恶性脑膜瘤原代细胞的培养和鉴定目的:培养恶性脑膜瘤原代细胞,为后续实验提供体外实验载体。方法:通过手术获取新鲜人脑膜瘤组织标本,利用化学消化法进行原代细胞的培养。通过细胞免疫荧光实验对所获取细胞进行脑膜瘤细胞特异性分子标记物鉴定。最后行裸鼠成瘤实验,观察恶性脑膜瘤原代细胞的致瘤能力,获取移植瘤标本后再次行标记物免疫组织化学分析。结果:培养并鉴定了两株间变性脑膜瘤(WHO Ⅲ级)原代细胞,细胞在显微镜下呈现双极或多极形态,生长旺盛,均已进行超过50次的细胞传代。两株恶性脑膜瘤细胞行免疫荧光实验提示上皮膜抗原(EMA)和波形蛋白(VIM)均阳性,裸鼠成瘤实验获取移植瘤行免疫组织化学分析EMA和VIM表达阳性,Ki-67比例分别高达40%和33%。另外,为进行对照实验,同样方法培养并鉴定出两株WHO Ⅰ级脑膜瘤原代细胞。WHO Ⅰ级脑膜瘤细胞传至第10代左右后细胞体积逐渐增大,增殖速率减缓。结论:经原代细胞培养和鉴定,我们获取了 2株WHO Ⅲ级和2株WHO Ⅰ级的人脑膜瘤原代细胞用于后续实验。第二部分RIZ1和UbcH10上下游关系的研究目的:明确UbcH10为RIZ1的下游分子。方法:通过蛋白印迹法检测4株脑膜瘤原代细胞中RIZ1和UbcH10的表达情况。构建针对RIZ1的过表达质粒,转染两株WHO Ⅲ级脑膜瘤原代细胞,观察UbcH10表达水平变化。最后通过免疫组织化学技术分析52例不同病理级别脑膜瘤组织标本中RIZ1和UbcH10的表达情况,并统计学分析两者的表达量有无相关性。结果:RIZ1在WHO Ⅰ级脑膜瘤原代细胞中高表达,在2株WHO Ⅲ级脑膜瘤原代细胞中表达较低,而UbcH10在WHO Ⅰ级脑膜瘤原代细胞中表达较低,在WHOⅢ级脑膜瘤原代细胞中表达较高。在2株WHO Ⅲ级脑膜瘤原代细胞中过表达RIZ1后,均检测到UbcH10的表达水平降低。52例不同级别脑膜瘤标本行免疫组织化学分析后发现,RIZ1的表达同脑膜瘤级别负相关,而UbcH10相反,同时两者的表达量负相关(P0.0001)。结论:UbcH10为RIZ1的下游分子。第三部分下调UbcH10对脑膜瘤原代细胞生物学行为影响的研究目的:初步研究UbcH10在脑膜瘤原代细胞中的生物学功能。方法:首先通过血清饥饿法将细胞同步化于G0/G1期,随后释放细胞,在此后的不同时间点检测UbcH10及细胞周期蛋白CyclinA2的表达变化。其次,设计合成针对UbcH10的siRNA干扰序列,转染至2株恶性脑膜瘤原代细胞中,qRT-PCR和蛋白印迹检测干扰效率。在UbcH10-siRNA转染脑膜瘤原代细胞24h后行一系列细胞功能学实验,检测敲低UbcH10在恶性脑膜瘤原代细胞中的表达后对细胞增殖、周期、迁移、侵袭、凋亡的影响。结果:UbcH10在细胞周期各期表达不同,在G0/G1期表达最低。所设计siRNA转染恶性脑膜瘤原代细胞后分别在mRNA和蛋白水平检测到UbcH10的表达显著下降。转染UbcH10-siRNA后,细胞增殖实验显示脑膜瘤原代细胞增殖能力显著下降,细胞周期实验提示细胞发生G2/M期阻滞,迁移和侵袭实验提示细胞运动能力下降,细胞凋亡实验提示脑膜瘤原代细胞凋亡比率增加,并引起相关凋亡蛋白表达变化。结论:UbcH10具有明显的细胞周期相关性,且在恶性脑膜瘤的进展中起着影响增殖、迁移、侵袭、凋亡等作用,是脑膜瘤细胞中潜在的致癌基因。第四部分RIZ1通过c-Myc调控UbcH10的机制研究目的:在细胞转录调控层面研究RIZ1通过c-Myc调控UbcH10的分子机制。方法:染色质免疫共沉淀(ChIP)实验检测c-Myc是否与UbcH10启动子结合。构建c-Myc在UbcH10启动子上结合位点的突变质粒,双荧光素酶报告基因实验分析RIZ1调控下游蛋白UbcH10是否依赖c-Myc。设计并构建针对c-Myc的RNA干扰慢病毒,并转染WHO Ⅲ级脑膜瘤原代细胞,在不同c-Myc背景下的恶性脑膜瘤原代细胞中分别转染RIZ1过表达质粒,检测UbcH10的表达变化情况。结果:ChIP实验提示c-Myc在UbcH10启动子序列上有两个稳定的结合位点。双荧光素酶报告基因实验提示RIZ1需依靠c-Myc调控UbcH10的启动子活性。设计并构建合成了针对c-Myc的RNA干扰慢病毒,经慢病毒转染后得到稳定敲低c-Myc表达的WHO Ⅲ级脑膜瘤原代细胞。通过在不同c-Myc背景下原代细胞中转染RIZ1过表达质粒,在野生型细胞和c-Myc稳定敲低细胞中比较UbcH10表达的下降程度发现差异明显,有统计学意义。结论:RIZ1通过c-Myc调控UbcH10的表达。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R739.45
【图文】：

影像学表现,人脑,脑膜瘤,来源

图１．１邋４株人脑膜瘤原代细胞来源患者的影像学表现逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｉｍａｇｉｎｇ邋ａｐｐｅａｒａｎｃｅｓ邋ｏｆ邋ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ邋ｏｆ邋４邋ｐｒｉｍａｒｙ邋ｍｅｎｉｎｇｉｏｍａ邋ｃｅｌｌｓ逡逑（Ｍｌ、Ｍ２来源于ＷＨＯ邋ＩＩＩ级间变性脑膜瘤，Ｍ３、Ｍ４来源于ＷＨＯ邋Ｉ级脑膜瘤，增逡逑强ＭＲＩ提示恶性脑膜瘤呈侵袭生长，且瘤内信号不均，部分呈分叶状，肿瘤边缘不逡逑规则。）逡逑逦表１．１脑膜瘤原代细胞来源标本临床详细资料逦逡逑住院号邋性别逦年龄逦病理诊断逦ＷＨＯ分级逡逑￣Ｍ＼逦５４０８５５逦＾逦４６逦间变性脑膜瘤逦ｎＦ逡逑Ｍ２逦５９７３３４逦男逦５８逦间变性脑膜瘤逦ＩＩＩ逡逑Ｍ３逦６１８７８７逦女逦５８逦脑膜皮型脑膜瘤逦Ｉ逡逑Ｍ４逦６３１５４９逦男逦６０逦脑膜皮型脑膜瘤逦Ｉ逡逑（二）主要实验药品及试剂逡逑高糖ＤＭＥＭ逦（加拿大ｗｉｓｅｎｔ公司）逡逑

形态图,脑膜瘤,形态,标记物

二、脑膜瘤原代细胞特异性标记物免疫荧光检测结果逡逑原代脑膜瘤原代细胞经培养传代后，于第４代行细胞免疫荧光染色，４组细胞胞逡逑质ＥＭＡ与ＶＩＭ表达均为阳性（图１．３）。逡逑Ｍ１（ＷＨ０邋ＩＩＩ）邋Ｍ２（ＷＨ０邋ＩＩＩ）邋Ｍ３（ＷＨ０邋Ｉ邋）邋Ｍ４（ＷＨ０邋Ｉ邋）逡逑ＢＤＢＨ逡逑ａｎａ逡逑－１７邋－逡逑

裸鼠移植瘤,免疫组织化学染色,脑膜瘤

逡逑图１．３邋４株脑膜瘤原代细胞行细胞免疫荧光染色结果逡逑Ｆｉｇ．邋１．３邋Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋４邋ｐｒｉｍａｒｙ邋ｍｅｎｉｎｇｉｏｍａ邋ｃｅｌｌｓ逡逑（细胞免疫荧光实验结果提示４株脑膜瘤原代细胞中ＥＭＡ和ＶＩＭ染色阳性，图中逡逑绿色荧光提示ＥＭＡ和ＶＭ在细胞质中表达，阳性染色率超过９０％，蓝色荧光为细逡逑胞核经Ｈｏｅｃｈｓｔ染色后表现，白色标尺＝２５ｇｍ。）逡逑三、脑膜瘤原代细胞裸鼠成瘤及移植瘤免疫组化结果逡逑对Ｍｌ邋（ＷＨＯ邋ＩＩＩ）和Ｍ２邋（ＷＨＯ邋ＩＩＩ）邋２株ＷＨＯ邋ＩＩＩ级脑膜瘤原代细胞进行裸鼠逡逑成瘤实验，观察其致瘤能力，接种２株细胞的雄性裸鼠均顺利成瘤，对所获取移植瘤逡逑行免疫组织化学分析，ＥＭＡ与ＶＭ均染色阳性，Ｋｉ－６７指数分别高达４０％和３３％（图逡逑１．４）。逡逑ＥＭＡ逦ＶＩＭ逦Ｋｉ－６７逡逑＇邋＿１邋．．逡逑Ｍ１逦．：偷．，ｉ邋．逡逑一逡逑Ｍ２邋？逦Ｖ邋：逡逑．—■．逦—逦W■—逡逑图１．４裸鼠移植瘤免疫组织化学染色逡逑Ｆｉｇ．邋１．４邋Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ邋ｉｎ邋ｎｕｄｅ邋ｍｉｃｅ逡逑（分别对Ｍｌ和Ｍ２细胞行裸鼠成瘤实验，获取移植瘤行免疫组织化学分析，ＥＭＡ逡逑和Ｖ１Ｍ均染色阳性

【相似文献】